Ringraziamo Jonatan Lucas per la sua assistenza tecnica con coltura cellulare alimentatore, Servei Estabulari de la UAB per cura degli animali e Domènec Martín per la registrazione del video. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R e Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC è beneficiario di una borsa di studio di PIF-UAB.

l'uso degli animali descritti nelle sezioni riportate di seguito è stato approvato dal comitato di etica animale e umana ricerca della Universitat Autònoma de Barcelona e dalla Departament d' &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ho Alimentació della Generalitat de Catalunya (protocollo #8741).
 1. inattivazione delle cellule feeder e deposito Nota: fibroblasti umani del prepuzio (HFF-1) precedentemente sono stati congelati in 1 mL di soluzione di congelamento composto da 90% siero bovino fetale (FBS) e 10% dimetil solfossido ( DMSO) e conservati in azoto liquido fino uso.
<ol><li>Scongelare una fiala criogenica di HFF-1 (1 mL) immergendo il flaconcino in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere lo scongelati contenuto del flaconcino criogenico a Dulbecco pre-riscaldato &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) completati con 10% FBS per rendere un 01:10 diluizione.</li>
	<li>Le cellule diluite (10 mL) di semi in una boccetta di T75 e loro coltura a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Il giorno successivo, cambiare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 10 mL di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.</li>
	<li>Cultura il HFFs e cambiare il mezzo ogni 48 h fino a quando la cultura raggiunge la fase confluente. L'operazione potrebbe richiedere circa 7-10 gg.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di inattivazione, diluire mitomicina C in DMEM supplementato con 10% FBS ad una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Incubare le cellule con la soluzione di inattivazione per 3 h a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di inattivazione e sciacquare le cellule tre volte con 2 mL di Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) per eliminare i resti di mitomycin C.</li>
	<li>Per staccare le cellule inattivate, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA pre-riscaldato e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Osservare le cellule al microscopio invertito per assicurare sono scollegati (obiettivo 10x con 0,3 apertura numerica o NA). Se non lo sono, li Incubare per un paio di minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare le cellule sotto il microscopio invertito.</li>
	<li>Pipetta la soluzione con una pipetta Pasteur al fine di dissociare i grumi di cellule.</li>
	<li>Neutralizzare la soluzione enzimatica aggiungendo 4 mL di DMEM completati con 10% FBS e risospendere.</li>
	<li>Prendere un'aliquota della sospensione cellulare e fare una diluizione 1: 100 in HBSS. Per determinare il numero di celle, è necessario caricare 10 µ l della diluizione in un Neubauer &#39; camera di s. Contare le celle che si trova in una delle piazze più grandi della camera sotto un microscopio invertito (obiettivo x 20 con un NA 0,45).
	<ol><li>Ripetere il conteggio in un totale di quattro grandi piazze. Calcolare il numero totale di cellule (N) n = numero medio di cellule contate x volume totale x diluizione x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugare il resto del campione per 5 min a 200 x g. gettare il surnatante e risospendere il sedimento con congelamento soluzione ad una concentrazione di 10 6 cellule per mL.</li>
	<li>Aliquota della sospensione in fiale criogeniche con 10 6 cellule (1 mL) ogni. Posizionare le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento e congelare a -80 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, conservare i flaconi criogenici in azoto liquido.</li>
</ol> 2. Coltura cellulare alimentatore <ol><li>da uno a quattro giorni prima di iniziare il processo di derivazione, disgelo criogenico flaconcino contenente 1 x 10 6 inattivato HFF-1 cellule in un bagno di acqua a 37 ° C.</li>
	<li>Fare una diluizione di 1:6 di HFF-1 scongelati nel pre-riscaldati DMEM completati con 10% FBS e mantenere la temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Riempire ogni pozzetto di una piastra a 4 pozzetti con 500 µ l di pre-riscaldato 0,2% gelatina da pelle porcina e tenere la piastra a 37 ° C per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere i 500 µ l di gelatina dai pozzetti e aggiungere 500 µ l della diluizione HFFs. Scuotere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme del HFFs sul fondo dei pozzetti. Evitare movimenti circolari, in caso contrario si concentreranno le cellule al centro del pozzo.</li>
	<li>Incubare la piastra almeno 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 per ottenere un monostrato di HFFs inattivato in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio invertito (obiettivo 10x con NA 0,3) e verifica che siano collegati e distribuiti in modo omogeneo. Modificare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 µ l di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.</li>
</ol> 3. Raccolta degli embrioni e cultura <ol><li>quattro giorni prima della raccolta degli embrioni, amministrare 5 IU della cavalla incinta &#39; gonadotropina del siero di s tramite l'iniezione intraperitoneale di topi femmina 6-12 settimane vecchio. 
	Nota: Abbiamo usato le femmine da 129S2 o B6CFAF1 ceppi, anche se le femmine da altri ceppi del mouse possono essere utilizzate. Tuttavia, quando mezzo di lavoro con le femmine da ceppi non permissivi (ad es. CBA), dovrebbe essere completato con 2i come indicato al punto 4.2.</li>
	<li>Dopo 48 h, amministrare 5 UI di gonadotropina corionica umana tramite l'iniezione intraperitoneale e accoppiare le femmine con i maschi, almeno 8 settimane di vita, con un rapporto 1:1. Separare le femmine dai maschi il giorno successivo.</li>
	<li>Il giorno prima della raccolta degli embrioni, preparare una coltura cellulare di 35 mm di Petri con alcune gocce di 40 µ l di KSOMaag supplementato con 4 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e riempire il piatto con olio minerale per coprire completamente le gocce. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO 2 per equilibrare il medium.</li>
	<li>Per preparare pipette di manipolazione dell'embrione, scaldate la parte più sottile di un vetro con punta lunga pipetta Pasteur utilizzando un bruciatore di Bunsen. Una volta morbido, ritirarlo dal fuoco e separare le due estremità. Romperlo fino alla lunghezza desiderata. Il diametro interno alla punta dovrebbe essere 100-150 µm.</li>
	<li>Eutanasia i topi femminili di dislocazione cervicale 45-48 h coitum dell'alberino (p.c.).</li>
	<li>Sezionare i topi per esporre la cavità addominale tagliando la pelle con forbici affilate lisce curve ed il peritoneum con forbici affilate dritto. Afferrare un utero con una pinza, tagliare l'ovidotto utilizzando delle forbici affilate dritto e inserirlo nella tamponata Hepes CZB medio (HCZB) 13 a 37 ° C. Ripetere la procedura per rimuovere altri ovidotto.</li>
	<li>Flush ovidotti con una siringa da 1 mL caricati con HCZB tenuto da forcipe orologiaio per raccogliere gli embrioni 2-cell. 
	Nota: Per preparare il lavaggio dell'ago prendere un ago ipodermico 30g, tagliare l'estremità e a terra su una punta smussata su una pietra abrasiva.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta di bocca, prendere gli embrioni, lavarli in HCZB e loro cultura nella piastra di coltura degli embrioni precedentemente preparato a 37 ° C e 5% CO 2 fino allo stadio di blastocisti. Fino a 50 embrioni possono essere coltivati in ogni goccia di 40 µ l. Monitorare lo sviluppo dell'embrione ogni 24 h sotto uno stereomicroscopio. 
	Nota: In alternativa, gli embrioni possono essere raccolti allo stadio di blastocisti per abbreviare in vitro coltura embrionale. In questo caso, eutanasia le femmine al giorno p.c. 3,5-4,5, sezionare l'utero. e lavare con HCZB.</li>
</ol> 4. Derivazione di cellule staminali <ol><li>preparazione delle piastre derivazione <ol><li>il giorno di embrione semina, preparare il supporto di derivazione arricchendo terreno DMEM con 100 µM 2-β mercaptoetanolo, 1 x gli aminoacidi Non essenziali , 20% di siero sostituzione e 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Se lo si desidera, aggiungere anche 1 µM dell'inibitore MEK PD0325901 e 3 µM dell'inibitore GSK3 CHIR99021 per ottenere un mezzo di 2i.</li>
		<li>Prendere la piastra a 4 pozzetti con il monostrato di HFFs inattivato (punto 2.6) dalla incubatrice. Rimuovere il mezzo e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato a ciascun pozzetto. Riporre la piastra nell'incubatore.</li>
	</ol></li> <li>Pellucide rimozione ed embrione semina <ol><li>preparare una coltura cellulare 35mm Petri con gocce tre 30 µ l di acido Tyrode &#39; s soluzione 14 e tre 30 µ l gocce di mezzo di derivazione. Coprire le gocce con olio minerale e mantenere il piatto a 37 ° C.</li>
		<li>Prendere la piastra di coltura dell'embrione dall'incubatrice. Uno per uno, trasferire le blastocisti dalle gocce di cultura a un'acida Tyrode &#39; goccia di soluzione di s usando una pipetta di manipolazione dell'embrione. Se possibile, selezionare solo le blastocisti espanse per avviare il processo di derivazione.</li>
		<li>Monitor la zona pellucida Digestione sotto lo stereomicroscopio. Appena scompare la zona pellucida, trasferire le blastocisti ad un calo medio di derivazione per lavare fuori il Tyrode acide &#39; soluzione di s.</li>
		<li>Prendere la piastra 4 pozzetti derivazione da incubatrice e seme uno privi di zona blastocisti nell'alimentatore di cellule in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Ritorno la piastra 4 pozzetti derivazione in incubatrice e coltura a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Modificare la crescita delle cellule staminali di monitoraggio e medie <ol><li>monitorare le culture ogni 24 h sotto un microscopio invertito (obiettivo X 20 con 0,45 NA). È importante notare se ci sono segni di differenziazione delle cellule staminali, quali le cellule refrattiva gonfiate che circondano l'escrescenza o anche spingendo l'alimentatore cellule da parte.</li>
		<li>Ogni altro giorno, cambiare il mezzo della cultura. Prendere la piastra a 4 pozzetti dall'incubatrice, rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato completato con LIF e 2i, se utilizzato. Mantenere la cultura fino a escrescenze sono osservati (6-8 giorni).</li>
	</ol></li></ol> 5. Coltura della cellula formativa e manutenzione <ol><li>preparare Kolle-come maniglie e pipette di manipolazione di cellule staminali. Seguire il passo 3.4 preparare pipette di manipolazione di cellule staminali con un diametro interno sulla punta di 250-300 µm. utilizzare l'altra parte della pipetta Pasteur tirata per preparare la maniglia Kolle-come. Calore e modellarlo fino ad ottenere un hook.</li>
	<li>Prendere la piastra di coltura 4 pozzetti fuori l'incubatrice e individuare l'escrescenza sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare il quadratino per spingere via le cellule differenziate e gli alimentatori che circondano l'escrescenza. 
	Nota: Per evitare eventuale differenziazione della conseguenza, è importante rimuovere tutte le cellule differenziate dal bordo dell'escrescenza.</li>
	<li>Aspirare l'escrescenza con una pipetta di manipolazione di cellule staminali e posizionarlo in un nuovo piatto in una goccia di tripsina-EDTA 50 µ l.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi per tagliare la conseguenza in più parti al fine di disaggregare esso sia meccanicamente che enzimaticamente.</li>
	<li>Subito, trasferire i frammenti di conseguenza in una fresca goccia di mezzo di derivazione per neutralizzare l'azione della tripsina.</li>
	<li>Trasferire i frammenti di conseguenza una nuova piastra a 4 pozzetti con un monostrato di alimentatori. Trasferimento fino a 10 frammenti per pozzetto e cultura li con il mezzo di derivazione a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Mantenere le colture delle cellule staminali per almeno sei settimane prima di considerare la linea mESC stabilita. Modificare il mezzo ogni altro giorno e sottocultura li una volta a settimana.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li><li>Wakayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+establishment+of+mouse+embryonic+stem+cell+lines+from+single+blastomeres+and+polar+bodies.">Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies.</a> Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).</li><li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+generation+of+C57BL/6J+mouse+embryonic+stem+cells+in+a+defined+serum-free+media.">Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media.</a> Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).</li><li>Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se mESC linea derivazione è una procedura ben nota ordinariamente utilizzata in molti laboratori, sua efficienza non è sempre più in alto come previsto a causa di molteplici fattori che possono disturbare la pluripotenza manutenzione. Nel presente articolo abbiamo illustrato, passo dopo passo, come stabilire linee mESC con alta efficienza utilizzando un protocollo semplice e affidabile. Queste efficienze sono simili a quelli segnalati nella letteratura.
Per garantire la massima effici...

Cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule pluripotenti derivate da embrioni preimpianto, che mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare sotto condizioni specifiche1. Basato su queste proprietà, ESC sono diventati uno strumento utile per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e di studi ingegneria del tessuto2.
ESC sono stati derivati per la prima volta da embrioni di topo preimpianto, originari del mouse ESC (mESC) linee con successo basso3,4. Per anni, l'efficienza di derivazione è rimasta bassa a causa della difficoltà di mantenere la pluripotenza in vitro. Inoltre la presenza di alimentatore cellule5, che migliorano l'efficienza di derivazione, promuovere allegato di Colonia e migliorare stabilità karyotypic6, diverse modifiche del protocollo piombo ad un miglioramento nella manutenzione di pluripotenza. Le più importanti furono l'aggiunta di fattore inibitorio di leucemia (LIF) a mESC coltura7,8, l'uso di embrioni dal 129S2 sfondo permissiva9 e la cultura della mescita con supplementato con definita siero, privo di potenziali fattori di differenziazione10. Più recentemente, una prova convincente ha dimostrato che l'aggiunta di un cocktail di due piccole molecole modulatori delle vie di segnalazione al terreno di coltura mESC (noto come 2i) non consiglia di mantenere la pluripotenza. La 2i cocktail è costituito da una combinazione dell'inibitore MEK PD0325901, che riduce i segnali di differenziazione inibendo la chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), e l'inibitore di GSK3β CHIR99021, che migliora la sopravvivenza delle cellule a bassa densità attivando la via di Wnt11.
Nel presente articolo, descriviamo un semplice protocollo per derivare in modo efficiente mESC linee da blastocisti di topo. Seguiamo le procedure standard, la coltura di embrioni da ceppi permissive su cellule di alimentatore in medium di derivazione completate con LIF e un siero sostituzione12. Seguendo questo protocollo, mESC linee può essere derivato con efficienze equivalenti a quelli ottenuti in mezzo 2i. Nonostante ciò, 2i possono essere aggiunti per evitare possibili problemi con pluripotenza manutenzione o quando si lavora con ceppi non permissivi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">1 mL sryringe</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:141px;">309628</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">2-&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:263px;">Acidic Tyrode&#39;s solution&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&#186;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&#186;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:263px;">Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-21200</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &#945;SMA and AFP mouse antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">CHIR990212</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1386</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CryoTube</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">3754518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">41640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>L0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&#186;C. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Flushing needle</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td>304000</td>
			<td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td>48724</td>
			<td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-11037</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">HBSS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">L0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Hepes-buffered CZB&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>See composition in Chatot et al, 1989</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Divasa-Farmavic</td>
			<td style="width:141px;">Veterin-Corion 3000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human foreskin fibroblasts</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:141px;">ATCCSCRC-1041</td>
			<td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td>&#160;10828-028</td>
			<td style="width:524px;">Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&#186;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">KSOMaag Evolve</td>
			<td style="width:199px;">Zenith Biotech</td>
			<td style="width:141px;">ZEKS-050</td>
			<td style="width:524px;">Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&#186;C and 5% CO2 a day prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:199px;">Merk Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:263px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Charles River/Harlan</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo tested. Photosensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:199px;">Serva</td>
			<td>2980501</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&#186;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse anti-tubulin &#946; III (Tuj1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:141px;">MMS-435P</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A5228</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-AFP</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">MAB1368</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti Oct3/4&#160;</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td style="width:141px;">Sc-5279</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">PD0325901</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1408</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (35mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Pregnant mare&#39;s serum gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Foligon</td>
			<td>Foligon-1000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Rabbit policlonal anti-Sox2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB5603</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">T75 falcon</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:141px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypsin-EDTA 10x</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">X0930</td>
			<td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

Mouse sulle cellule staminali embrionali (mESC) derivazione è il processo da cui pluripotenti vengono stabilite linee cellulari da embrioni preimpianto. Queste linee mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare in condizioni specifiche. Grazie a queste proprietà, mESC sono uno strumento utile in medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e gli studi di ingegneria tissutale. Questo articolo viene descritto un semplice protocollo per ottenere linee mESC con efficienze di derivazione alta (60-80%) coltivando blastocisti da diversi ceppi di topi permissiva su cellule di alimentatore in medium definito completati con fattore inibitorio di leucemia. Il protocollo può anche applicarsi per derivare in modo efficiente mESC linee da diversi ceppi di topi non permissivi, per semplice aggiunta di un cocktail di due piccole molecole inibitori al medium di derivazione (2i medio). Procedure dettagliate sulla preparazione e sulla coltura di cellule di alimentatore, raccolta e cultura d'embrioni di topo e derivazione e mESC linee sono fornite. Questo protocollo non richiede attrezzature specializzate e può essere effettuato in qualsiasi laboratorio con competenze di cultura di base su cellule di mammifero.

A seguito di questo protocollo, oltre il 95% della formazione di conseguenza dovrebbe avvenire dopo la prima settimana della cultura (Figura 1A). Creazione di linee di mESC dopo sei passaggi è variabile tra repliche sperimentali, con una media di successo del 60-80%. L'aggiunta di 2i non migliora significativamente i risultati quando si lavora con diversi ceppi di topi permissiva, come quelli con un background di 129S2, ma è necessario quando si lavora con ...

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Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Derivazione di cellule cardiache progenitrici di cellule staminali embrionali

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Derivazione efficiente di cellule retiniche epitelio pigmentato da cellule staminali

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Derivazione di Cardiomyocytes altamente purificato da cellule staminali umane pluripotenti indotte utilizzando piccoli Differenziazione Molecola-modulato e successiva glucosio Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...