Name: derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos at JoVE.com

Ringraziamo Jonatan Lucas per la sua assistenza tecnica con coltura cellulare alimentatore, Servei Estabulari de la UAB per cura degli animali e Domènec Martín per la registrazione del video. Questo lavoro è stato supportato dal Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R e Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC è beneficiario di una borsa di studio di PIF-UAB.

l'uso degli animali descritti nelle sezioni riportate di seguito è stato approvato dal comitato di etica animale e umana ricerca della Universitat Autònoma de Barcelona e dalla Departament d' &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ho Alimentació della Generalitat de Catalunya (protocollo #8741).
 1. inattivazione delle cellule feeder e deposito Nota: fibroblasti umani del prepuzio (HFF-1) precedentemente sono stati congelati in 1 mL di soluzione di congelamento composto da 90% siero bovino fetale (FBS) e 10% dimetil solfossido ( DMSO) e conservati in azoto liquido fino uso.
<ol><li>Scongelare una fiala criogenica di HFF-1 (1 mL) immergendo il flaconcino in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Aggiungere lo scongelati contenuto del flaconcino criogenico a Dulbecco pre-riscaldato &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) completati con 10% FBS per rendere un 01:10 diluizione.</li>
	<li>Le cellule diluite (10 mL) di semi in una boccetta di T75 e loro coltura a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Il giorno successivo, cambiare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 10 mL di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.</li>
	<li>Cultura il HFFs e cambiare il mezzo ogni 48 h fino a quando la cultura raggiunge la fase confluente. L'operazione potrebbe richiedere circa 7-10 gg.</li>
	<li>Per preparare la soluzione di inattivazione, diluire mitomicina C in DMEM supplementato con 10% FBS ad una concentrazione finale di 10 µ g/mL. Incubare le cellule con la soluzione di inattivazione per 3 h a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di inattivazione e sciacquare le cellule tre volte con 2 mL di Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) per eliminare i resti di mitomycin C.</li>
	<li>Per staccare le cellule inattivate, aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA pre-riscaldato e incubare per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Osservare le cellule al microscopio invertito per assicurare sono scollegati (obiettivo 10x con 0,3 apertura numerica o NA). Se non lo sono, li Incubare per un paio di minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Controllare le cellule sotto il microscopio invertito.</li>
	<li>Pipetta la soluzione con una pipetta Pasteur al fine di dissociare i grumi di cellule.</li>
	<li>Neutralizzare la soluzione enzimatica aggiungendo 4 mL di DMEM completati con 10% FBS e risospendere.</li>
	<li>Prendere un'aliquota della sospensione cellulare e fare una diluizione 1: 100 in HBSS. Per determinare il numero di celle, è necessario caricare 10 µ l della diluizione in un Neubauer &#39; camera di s. Contare le celle che si trova in una delle piazze più grandi della camera sotto un microscopio invertito (obiettivo x 20 con un NA 0,45).
	<ol><li>Ripetere il conteggio in un totale di quattro grandi piazze. Calcolare il numero totale di cellule (N) n = numero medio di cellule contate x volume totale x diluizione x 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Centrifugare il resto del campione per 5 min a 200 x g. gettare il surnatante e risospendere il sedimento con congelamento soluzione ad una concentrazione di 10 6 cellule per mL.</li>
	<li>Aliquota della sospensione in fiale criogeniche con 10 6 cellule (1 mL) ogni. Posizionare le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento e congelare a -80 ° C.</li>
	<li>Il giorno successivo, conservare i flaconi criogenici in azoto liquido.</li>
</ol> 2. Coltura cellulare alimentatore <ol><li>da uno a quattro giorni prima di iniziare il processo di derivazione, disgelo criogenico flaconcino contenente 1 x 10 6 inattivato HFF-1 cellule in un bagno di acqua a 37 ° C.</li>
	<li>Fare una diluizione di 1:6 di HFF-1 scongelati nel pre-riscaldati DMEM completati con 10% FBS e mantenere la temperatura a 37 ° C.</li>
	<li>Riempire ogni pozzetto di una piastra a 4 pozzetti con 500 µ l di pre-riscaldato 0,2% gelatina da pelle porcina e tenere la piastra a 37 ° C per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere i 500 µ l di gelatina dai pozzetti e aggiungere 500 µ l della diluizione HFFs. Scuotere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme del HFFs sul fondo dei pozzetti. Evitare movimenti circolari, in caso contrario si concentreranno le cellule al centro del pozzo.</li>
	<li>Incubare la piastra almeno 24 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 per ottenere un monostrato di HFFs inattivato in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Il giorno successivo, osservare le cellule al microscopio invertito (obiettivo 10x con NA 0,3) e verifica che siano collegati e distribuiti in modo omogeneo. Modificare il mezzo per eliminare i resti di DMSO. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 µ l di pre-riscaldato DMEM supplementato con 10% FBS.</li>
</ol> 3. Raccolta degli embrioni e cultura <ol><li>quattro giorni prima della raccolta degli embrioni, amministrare 5 IU della cavalla incinta &#39; gonadotropina del siero di s tramite l'iniezione intraperitoneale di topi femmina 6-12 settimane vecchio. 
	Nota: Abbiamo usato le femmine da 129S2 o B6CFAF1 ceppi, anche se le femmine da altri ceppi del mouse possono essere utilizzate. Tuttavia, quando mezzo di lavoro con le femmine da ceppi non permissivi (ad es. CBA), dovrebbe essere completato con 2i come indicato al punto 4.2.</li>
	<li>Dopo 48 h, amministrare 5 UI di gonadotropina corionica umana tramite l'iniezione intraperitoneale e accoppiare le femmine con i maschi, almeno 8 settimane di vita, con un rapporto 1:1. Separare le femmine dai maschi il giorno successivo.</li>
	<li>Il giorno prima della raccolta degli embrioni, preparare una coltura cellulare di 35 mm di Petri con alcune gocce di 40 µ l di KSOMaag supplementato con 4 mg/mL albumina di siero bovino (BSA) e riempire il piatto con olio minerale per coprire completamente le gocce. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO 2 per equilibrare il medium.</li>
	<li>Per preparare pipette di manipolazione dell'embrione, scaldate la parte più sottile di un vetro con punta lunga pipetta Pasteur utilizzando un bruciatore di Bunsen. Una volta morbido, ritirarlo dal fuoco e separare le due estremità. Romperlo fino alla lunghezza desiderata. Il diametro interno alla punta dovrebbe essere 100-150 µm.</li>
	<li>Eutanasia i topi femminili di dislocazione cervicale 45-48 h coitum dell'alberino (p.c.).</li>
	<li>Sezionare i topi per esporre la cavità addominale tagliando la pelle con forbici affilate lisce curve ed il peritoneum con forbici affilate dritto. Afferrare un utero con una pinza, tagliare l'ovidotto utilizzando delle forbici affilate dritto e inserirlo nella tamponata Hepes CZB medio (HCZB) 13 a 37 ° C. Ripetere la procedura per rimuovere altri ovidotto.</li>
	<li>Flush ovidotti con una siringa da 1 mL caricati con HCZB tenuto da forcipe orologiaio per raccogliere gli embrioni 2-cell. 
	Nota: Per preparare il lavaggio dell'ago prendere un ago ipodermico 30g, tagliare l'estremità e a terra su una punta smussata su una pietra abrasiva.</li>
	<li>Utilizzando l'apparato di pipetta di bocca, prendere gli embrioni, lavarli in HCZB e loro cultura nella piastra di coltura degli embrioni precedentemente preparato a 37 ° C e 5% CO 2 fino allo stadio di blastocisti. Fino a 50 embrioni possono essere coltivati in ogni goccia di 40 µ l. Monitorare lo sviluppo dell'embrione ogni 24 h sotto uno stereomicroscopio. 
	Nota: In alternativa, gli embrioni possono essere raccolti allo stadio di blastocisti per abbreviare in vitro coltura embrionale. In questo caso, eutanasia le femmine al giorno p.c. 3,5-4,5, sezionare l'utero. e lavare con HCZB.</li>
</ol> 4. Derivazione di cellule staminali <ol><li>preparazione delle piastre derivazione <ol><li>il giorno di embrione semina, preparare il supporto di derivazione arricchendo terreno DMEM con 100 µM 2-β mercaptoetanolo, 1 x gli aminoacidi Non essenziali , 20% di siero sostituzione e 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Se lo si desidera, aggiungere anche 1 µM dell'inibitore MEK PD0325901 e 3 µM dell'inibitore GSK3 CHIR99021 per ottenere un mezzo di 2i.</li>
		<li>Prendere la piastra a 4 pozzetti con il monostrato di HFFs inattivato (punto 2.6) dalla incubatrice. Rimuovere il mezzo e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato a ciascun pozzetto. Riporre la piastra nell'incubatore.</li>
	</ol></li> <li>Pellucide rimozione ed embrione semina <ol><li>preparare una coltura cellulare 35mm Petri con gocce tre 30 µ l di acido Tyrode &#39; s soluzione 14 e tre 30 µ l gocce di mezzo di derivazione. Coprire le gocce con olio minerale e mantenere il piatto a 37 ° C.</li>
		<li>Prendere la piastra di coltura dell'embrione dall'incubatrice. Uno per uno, trasferire le blastocisti dalle gocce di cultura a un'acida Tyrode &#39; goccia di soluzione di s usando una pipetta di manipolazione dell'embrione. Se possibile, selezionare solo le blastocisti espanse per avviare il processo di derivazione.</li>
		<li>Monitor la zona pellucida Digestione sotto lo stereomicroscopio. Appena scompare la zona pellucida, trasferire le blastocisti ad un calo medio di derivazione per lavare fuori il Tyrode acide &#39; soluzione di s.</li>
		<li>Prendere la piastra 4 pozzetti derivazione da incubatrice e seme uno privi di zona blastocisti nell'alimentatore di cellule in ciascun pozzetto.</li>
		<li>Ritorno la piastra 4 pozzetti derivazione in incubatrice e coltura a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Modificare la crescita delle cellule staminali di monitoraggio e medie <ol><li>monitorare le culture ogni 24 h sotto un microscopio invertito (obiettivo X 20 con 0,45 NA). È importante notare se ci sono segni di differenziazione delle cellule staminali, quali le cellule refrattiva gonfiate che circondano l'escrescenza o anche spingendo l'alimentatore cellule da parte.</li>
		<li>Ogni altro giorno, cambiare il mezzo della cultura. Prendere la piastra a 4 pozzetti dall'incubatrice, rimuovere il mezzo da ogni pozzetto e aggiungere 800 µ l di terreno di derivazione pre-riscaldato completato con LIF e 2i, se utilizzato. Mantenere la cultura fino a escrescenze sono osservati (6-8 giorni).</li>
	</ol></li></ol> 5. Coltura della cellula formativa e manutenzione <ol><li>preparare Kolle-come maniglie e pipette di manipolazione di cellule staminali. Seguire il passo 3.4 preparare pipette di manipolazione di cellule staminali con un diametro interno sulla punta di 250-300 µm. utilizzare l'altra parte della pipetta Pasteur tirata per preparare la maniglia Kolle-come. Calore e modellarlo fino ad ottenere un hook.</li>
	<li>Prendere la piastra di coltura 4 pozzetti fuori l'incubatrice e individuare l'escrescenza sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare il quadratino per spingere via le cellule differenziate e gli alimentatori che circondano l'escrescenza. 
	Nota: Per evitare eventuale differenziazione della conseguenza, è importante rimuovere tutte le cellule differenziate dal bordo dell'escrescenza.</li>
	<li>Aspirare l'escrescenza con una pipetta di manipolazione di cellule staminali e posizionarlo in un nuovo piatto in una goccia di tripsina-EDTA 50 µ l.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi per tagliare la conseguenza in più parti al fine di disaggregare esso sia meccanicamente che enzimaticamente.</li>
	<li>Subito, trasferire i frammenti di conseguenza in una fresca goccia di mezzo di derivazione per neutralizzare l'azione della tripsina.</li>
	<li>Trasferire i frammenti di conseguenza una nuova piastra a 4 pozzetti con un monostrato di alimentatori. Trasferimento fino a 10 frammenti per pozzetto e cultura li con il mezzo di derivazione a 37 ° C e 5% CO 2.</li>
	<li>Mantenere le colture delle cellule staminali per almeno sei settimane prima di considerare la linea mESC stabilita. Modificare il mezzo ogni altro giorno e sottocultura li una volta a settimana.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Anche se mESC linea derivazione è una procedura ben nota ordinariamente utilizzata in molti laboratori, sua efficienza non è sempre più in alto come previsto a causa di molteplici fattori che possono disturbare la pluripotenza manutenzione. Nel presente articolo abbiamo illustrato, passo dopo passo, come stabilire linee mESC con alta efficienza utilizzando un protocollo semplice e affidabile. Queste efficienze sono simili a quelli segnalati nella letteratura.
Per garantire la massima effici...

Cellule staminali embrionali (ESC) sono cellule pluripotenti derivate da embrioni preimpianto, che mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare sotto condizioni specifiche1. Basato su queste proprietà, ESC sono diventati uno strumento utile per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e di studi ingegneria del tessuto2.
ESC sono stati derivati per la prima volta da embrioni di topo preimpianto, originari del mouse ESC (mESC) linee con successo basso3,4. Per anni, l'efficienza di derivazione è rimasta bassa a causa della difficoltà di mantenere la pluripotenza in vitro. Inoltre la presenza di alimentatore cellule5, che migliorano l'efficienza di derivazione, promuovere allegato di Colonia e migliorare stabilità karyotypic6, diverse modifiche del protocollo piombo ad un miglioramento nella manutenzione di pluripotenza. Le più importanti furono l'aggiunta di fattore inibitorio di leucemia (LIF) a mESC coltura7,8, l'uso di embrioni dal 129S2 sfondo permissiva9 e la cultura della mescita con supplementato con definita siero, privo di potenziali fattori di differenziazione10. Più recentemente, una prova convincente ha dimostrato che l'aggiunta di un cocktail di due piccole molecole modulatori delle vie di segnalazione al terreno di coltura mESC (noto come 2i) non consiglia di mantenere la pluripotenza. La 2i cocktail è costituito da una combinazione dell'inibitore MEK PD0325901, che riduce i segnali di differenziazione inibendo la chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK), e l'inibitore di GSK3β CHIR99021, che migliora la sopravvivenza delle cellule a bassa densità attivando la via di Wnt11.
Nel presente articolo, descriviamo un semplice protocollo per derivare in modo efficiente mESC linee da blastocisti di topo. Seguiamo le procedure standard, la coltura di embrioni da ceppi permissive su cellule di alimentatore in medium di derivazione completate con LIF e un siero sostituzione12. Seguendo questo protocollo, mESC linee può essere derivato con efficienze equivalenti a quelli ottenuti in mezzo 2i. Nonostante ciò, 2i possono essere aggiunti per evitare possibili problemi con pluripotenza manutenzione o quando si lavora con ceppi non permissivi.

<table><tbody><tr><td>1 mL sryringe</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode&#039;s solution&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&amp;ordm;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&amp;ordm;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &amp;alpha;SMA and AFP mouse antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&amp;ordm;C. Aliquot and store at -20&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Flushing needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>304000</td><td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See composition in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Human foreskin fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;10828-028</td><td>Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&amp;ordm;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&amp;ordm;C and 5% CO2 a day prior to use.</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo tested. Photosensitive.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&amp;ordm;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin &amp;beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-AFP</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td></tr><tr><td>Petri dish (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&#039;s serum gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td></tr></tbody></table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

Mouse sulle cellule staminali embrionali (mESC) derivazione è il processo da cui pluripotenti vengono stabilite linee cellulari da embrioni preimpianto. Queste linee mantengono la capacità di auto-rinnovarsi o differenziare in condizioni specifiche. Grazie a queste proprietà, mESC sono uno strumento utile in medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e gli studi di ingegneria tissutale. Questo articolo viene descritto un semplice protocollo per ottenere linee mESC con efficienze di derivazione alta (60-80%) coltivando blastocisti da diversi ceppi di topi permissiva su cellule di alimentatore in medium definito completati con fattore inibitorio di leucemia. Il protocollo può anche applicarsi per derivare in modo efficiente mESC linee da diversi ceppi di topi non permissivi, per semplice aggiunta di un cocktail di due piccole molecole inibitori al medium di derivazione (2i medio). Procedure dettagliate sulla preparazione e sulla coltura di cellule di alimentatore, raccolta e cultura d'embrioni di topo e derivazione e mESC linee sono fornite. Questo protocollo non richiede attrezzature specializzate e può essere effettuato in qualsiasi laboratorio con competenze di cultura di base su cellule di mammifero.

A seguito di questo protocollo, oltre il 95% della formazione di conseguenza dovrebbe avvenire dopo la prima settimana della cultura (Figura 1A). Creazione di linee di mESC dopo sei passaggi è variabile tra repliche sperimentali, con una media di successo del 60-80%. L'aggiunta di 2i non migliora significativamente i risultati quando si lavora con diversi ceppi di topi permissiva, come quelli con un background di 129S2, ma è necessario quando si lavora con ...

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Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Views.  Universitat Autònoma de Barcelona. Questo articolo descrive un protocollo per derivare e cultura pluripotenti linee di cellule staminali da embrioni di topo allo stadio di blastocisti efficacemente.

Video: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Ricerca

Biologia

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Biologia dello sviluppo

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

Riepilogo

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Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Analisi quantitativa di espressione della proteina per studiare Lineage specifica nel topo preimpianto embrioni

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

L'isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

Derivazione di cellule staminali trofoblasto mouse da blastocisti

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

Generazione di topi derivati da cellule staminali pluripotenti indotte

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Derivazione di linee di cellule staminali da embrioni di Preimplantation Mouse

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Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

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