La nostra metodologia semplice e pratica può essere utilizzata per ottenere abbondanti ADSCS per lo studio dell'adipogenesi PVAT in vitro e per testare i normali farmaci contro l'obesità e le malattie cardiovascolari correlate. Il vantaggio di questo metodo è la fluorescenza intrinseca degli NCADSC della biotina è necessario etichettare le cellule con anticorpi coniugati flou-cromo per FACS o smistamento cellulare magnetico attivato. Questo metodo può essere usato per acquisire abbondante ADSC derivato dalle cellule della cresta neurale dall'ectoderma per studiare l'adipogenesi PVAT, o lipogenesi in vitro.
L'uso di giovani topi e l'esperienza con l'adipogenesi cautera e indotta significa che le cellule 3T3 sono fondamentali per il successo di questo protocollo. A dimostrare la procedura saranno Yiding Qi, uno studente laureato, e Lian Xu, un tecnico del mio laboratorio. Per la dissezione PAAT, dopo aver sterilizzato la carcassa di topo in etanolo al 75% per cinque minuti, utilizzare le forbici per tagliare e separare la pelle sull'addome.
Tagliare lungo la linea mediana ventrale dal bacino al collo e aprire l'addome. Spostare il fegato per esporre il diaframma e tagliare il diaframma e le costole su entrambi i lati della linea mediana. Sbucciare le costole per esporre il cuore e i polmoni.
E rimuovere i polmoni e il timo. Estrarre il PAAT insieme all'aorta e al cuore in una piastra di Petri. E tagliare l'aorta alla radice aortica per rimuovere il cuore.
Quindi, fai un taglio tra l'arco aortico e l'aorta discendente. Separare accuratamente il tessuto adiposo che circonda entrambe le strutture e le arterie carotide comuni sinistra e destra dalla parete toracica posteriore. È importante separare il PAAT dalla radice e come vasi vascolari più grandi con attenzione, è la presenza di cellule della parete vascolare che può influire sull'efficienza FACS.
Mettere il tessuto in una piastra di Petri contenente tampone HBSS ghiacciato. E utilizzare forcep sterili per rimuovere il più possibile la vascucolatura e la fascia. Quindi, trasferire il tessuto adiposo in un tubo Eppendorf a due millilitri, contenente il punto cinque millilitri di tampone HBSS ghiacciato sul ghiaccio.
Una volta raccolto tutto il PAAT, trasferire il tessuto adiposo raccolto in un nuovo tubo di micro-centrifuga a due millilitri contenente un millilitro di mezzo di digestione appena preparato. E usa le forbici chirurgiche per tritare i tessuti. Trasferire i liquami tissutali in un tubo da 50 millimetri contenente nove millilitri di mezzo di digestione fresco.
E usa una pipetta da un millilitro per triturare i tessuti 10 volte. Quando è stata ottenuta una soluzione omogenea, incubare il tubo per 30-45 minuti a 37 gradi Celsius e 100 giri al minuto, controllando ogni cinque-10 minuti per prevenire la sovradigestione. Quando si può osservare una soluzione di tessuto adiposo omogeneo giallo chiaro al momento del delicato vortice del tubo, interrompere la digestione con cinque millilitri di HDMEM integrati con siero bovino fetale al 10%.
Dopo un'accurata miscelazione, centrifugare il campione di tessuto adiposo. La frazione cellulare vascolare stromale sarà visibile come un pellet brunastro. Sospendere di nuovo il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri.
Raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. E sospendere delicatamente il pellet in cinque millilitri di tampone di lysis degli etrociti. Trasferire la sospensione su un tubo da 15 millilitri.
Dopo 10 minuti, interrompere la reazione con due centrifugazioni in 10 millilitri di PBS, integrate con siero bovino fetale all'1%. Dopo la seconda centrifugazione, sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di mezzo di coltura sul ghiaccio. E raccogliere le cellule con una centrifugazione finale.
Quindi, sospendere di nuovo le celle in cinque millilitri di buffer FACS per il conteggio. Per impostare una coltura NCADSC, dopo il loro isolamento da parte di FACS secondo protocolli standard, posizionare le cellule a una concentrazione di coltura di cinque volte 10 alla terza parte per centimetro quadrata in ogni pozzo, una piastra di coltura di dodici pozzi. Mezzo di coltura incompleto a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 20-24 ore.
Il giorno dopo, lavare le cellule con 37 gradi Celsius PBS e nutrire la coltura con un mezzo di coltura fresco. Quando la coltura raggiunge l'80-90% di confluenza, trattare le cellule con due millilitri dello 0,25% di tripside EDTA per pozzo per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono state staccate dal fondo della piastra, neutralizzare gli enzimi con due millilitri di terreno coltivato e raccogliere le cellule raccolte per centrifugazione.
Sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di mezzo di coltura fresco per il conteggio. E seminare le cellule in una nuova piastra di coltura di 12 pozzi in una concentrazione di cinque volte 10-terza cellule per centimetro al quadrato. Quindi, sospendere nuovamente le restanti cellule in un mezzo di coltura integrato con solfossido di dimetile al 10% per lo stoccaggio congelato in azoto liquido.
Per indurre la differenziazione adipogenica, quando le cellule raggiungono una confluenza dall'80 al 90%, trattare le cellule con mezzo di induzione adipogenico marrone o bianco per due giorni, a seconda dei casi. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente le cellule due volte con PBS prima di aggiungere ad ogni pozzo il mezzo di induzione adipogenico fresco appropriato e riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per altri tre o cinque giorni di incubazione. Gli NCADSC colti raggiungono una confluenza dall'80 al 90% dopo sette-otto giorni di cultura.
E dimostrare una morfologia espansa simile alla fibra di vetro. Per confermare ulteriormente il loro potenziale adipogenico, è possibile eseguire la colorazione rosso olio degli NCADSC differenziati per rilevare adipociti maturi. Tipicamente, gli adipociti maturi si osservano dopo otto giorni di induzione adipogenica bianca o marrone con oltre il 60% degli NCADSC che mostrano differenziazione adipogenica.
Si noti che gli NCADSC dimostrano un potenziale adipogenico notevolmente ridotto dopo la passaging. L'immunoblotting e la PCR quantitativa in tempo reale rivelano che l'espressione di proteine e geni relativi specifici adipocite aumenta significativamente negli NCADSC adipogenicamente differenziati dopo otto giorni di induzione adipogenica bianca. Allo stesso modo, l'espressione di geni specifici adipocite e geni specifici dell'adipocite marrone, aumenta significativamente anche dopo otto giorni di induzione adipogenica marrone.
Poiché la maggior parte del protocollo di isolamento NCADSC è semplice, economico e non richiede l'uso di anticorpi, per questo, la forte intensità del fluido di IFP può migliorare l'efficienza di nutrimento FACS.
