Negli ultimi anni, l'incapsulamento all'interno di vescicole lipidiche a doppio strato di dimensioni cellulari si è dimostrato un metodo utile per esperimenti di ricostituzione in vitro. Il metodo che presentiamo aiuterà notevolmente con la ricostituzione del citoscheletro nella ricerca sulle cellule sintetiche. Con questo metodo, possiamo generare vescicole unilamellari giganti di dimensioni eterogenee con un alto rendimento.
Il tempo di generazione delle vescicole è significativamente ridotto rispetto alla tecnica convenzionale cDICE. Possiamo incapsulare sistemi di trascrizione-traduzione privi di cellule isolati da processi cellulari complessi e simultaneamente verificati per esaminare i percorsi molecolari. Questo metodo può essere utilizzato per assemblare protocellule minime verso la creazione di cellule sintetiche funzionali.
Inizia a preparare una miscela olio-lipidi trasferendo dioleoil-fosfocolina, colesterolo e rodamina PE in una fiala di vetro da 15 millilitri. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di cloroformio nel flaconcino. Pipettare 7,2 millilitri di olio di silicone e 1,8 millilitri di olio minerale in un tubo separato da 15 millilitri e mescolare gli oli vorticosamente ad una velocità di 3.200 rotazioni al minuto per 10 secondi.
Quindi, aggiungere la miscela di olio al flaconcino contenente la miscela lipidica e cloroformio e ruotare la miscela alla velocità di 3.200 rotazioni al minuto per 10-15 secondi fino a quando la miscela lipidica in olio risultante è leggermente torbida, poiché i lipidi non sono completamente disciolti nell'olio. Successivamente, sonicare il lipide in dispersione di olio in un sonicatore da bagno con potenza ultrasonica di 80 watt e una frequenza operativa di 40 kilohertz per 30 minuti a temperatura ambiente. Se non utilizzato immediatamente, conservare la miscela lipidico-olio a quattro gradi Celsius per 24 ore.
Per generare le vescicole, utilizzare l'assemblaggio con un albero stampato in 3D in resina nera montato sulla piastra di agitazione del piano di lavoro alla velocità di 1.200 rotazioni al minuto. Quindi, montare l'interfaccia a goccia continua stampata in 3D che attraversa l'incapsulamento, o camera cDICE, realizzata con la resina trasparente sull'albero in resina nera. Preparare la soluzione di actina da 1 a 10 micromolari in tampone globulare di actina o tampone G, inclusa l'attina 488 al 10%ATO.
Per iniziare la polimerizzazione dell'actina, aggiungere il tampone di polimerizzazione dell'actina filamentosa, o tampone F, in soluzione di actina su ghiaccio e quindi mantenere le soluzioni sul ghiaccio per rallentare la polimerizzazione dell'actina prima di aggiungere un reticolante. Per preparare le proteine leganti l'actina, o ABP, da 1,75 milligrammi per millilitro di stock di fascina, aliquota 1,57 microlitri di fascina in un microtubo separato. Quindi, aggiungere il 7,5% del gradiente di densità medio nella soluzione di actina per creare un gradiente di densità tra la fase acquosa esterna e quella interna e facilitare la sedimentazione di vescicole unilamellari giganti o GUV.
Quindi, erogare 700 microlitri di glucosio 200 millimolare come soluzione esterna nella camera. Aggiungere abbastanza miscela lipidico-olio nella camera fino a quando il 60%-80% della camera è riempito. Si formerà un'interfaccia tra la miscela lipidico-olio e la soluzione esterna.
Preparare una miscela actina-ABP trasferendo gli ABP nella soluzione di actina. Quindi, utilizzare una normale pipetta da 100 a 1.000 microlitri per trasferire i 700 microlitri della miscela lipidico-olio nella miscela actina-ABP. Pipettare su e giù otto volte per generare goccioline di emulsione monostrato lipidica di dimensioni cellulari con un diametro da 7 a 100 micron.
Utilizzare la stessa pipetta da 100 a 1.000 microlitri per erogare l'intera emulsione nella camera rotante. Le goccioline acquisiranno un secondo foglietto di lipidi incrociando il monostrato lipidico all'interfaccia olio-soluzione esterna, formando così GUV. Al termine, rimuovere la camera dalla piastra di agitazione e scartare la maggior parte della miscela lipidico-olio inclinando la camera nel contenitore dei rifiuti.
Tenendo la camera con il coperchio rivolto verso l'interno, aprire il coperchio della camera e inclinare leggermente la camera verso l'interno. L'interfaccia tra la soluzione esterna contenente GUV e la miscela lipidico-olio sarà visibile dall'apertura della camera in cui si trova il coperchio. Utilizzare una pipetta per raccogliere una soluzione esterna sufficiente contenente GUV ed erogare da 50 a 300 microlitri della soluzione esterna in una piastra a 96 pozzetti per ottenere una densità appropriata di GUV.
Per l'imaging dei GUV, impostare la piastra a 96 pozzetti sul palco di un microscopio invertito dotato di una lente obiettivo 60X ad immersione in olio. Apri una sequenza di immagini di interesse in un software di elaborazione delle immagini, ImageJ Fiji, e identifica l'immagine con la massima intensità. Tieni premuto Ctrl Maiusc C per aprire la finestra luminosità e contrasto e fai clic sulla scheda di ripristino.
Nel menu ImageJ Fiji, vai alle schede Analizza e Imposta scala per inserire la distanza fisica e l'unità note per ogni pixel dell'immagine. Una volta fatto, vai ai pulsanti Immagine, Stack e quindi Progetto 3D per ricostruire un'immagine 3D dalla pila Z. Impostare il metodo di proiezione come Punto di luminosità, Spaziatura sezioni su 0,5 micrometri, quindi selezionare la casella Interpola.
Utilizzare le opzioni predefinite per il resto delle impostazioni e acquisire immagini. L'immagine rappresentativa mostra un'immagine confocale di GUV marcati con rhodamine PE con fascin-actina incapsulati. Il trasferimento delle proteine leganti l'actina nella soluzione di actina, quindi l'aggiunta della miscela lipidico-olio e la generazione di goccioline lipidiche monostrato dovrebbero avvenire in pochi secondi per evitare la formazione di reti di actina prima dell'incapsulamento.
Abbiamo usato questa tecnica cDICE modificata per esaminare i ruoli dei diversi cross-linker di actin net nell'organizzazione delle reti di actina. Ci aspettiamo che questo metodo aiuterà altri ricercatori a esplorare la regolazione di altre proteine del citoscheletro.
