Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R03 NS087322-01 a Dong, X.

NOTA: Gli studi sugli animali inclusi in tutte le procedure sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali presso l&#39;Università di North Texas Health Science Center. 1. Preparazione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti <ol><li> Sciogliere gli eccipienti, fosfatidilcolina (PC), sfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), colestero olio (CO) e D-a-tocoferil polietilenglicol-succinato (TPGS) in etanolo per preparare soluzioni a 1 mg / ml. NOTA: Le soluzioni di stock sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. L&#39;oleato di colesterilico è stato conservato in bottiglie scure. Le soluzioni PC, SM, PS e CO sono state stabili fino a 6, 3, 12 e 12 mesi rispettivamente a -20 ° C. La soluzione TPGS era stabile per almeno 12 mesi a -20 ° C. </li><li> Mescolare 10 μL di NGF (1 mg / ml in acqua) con 10 μL di protamina USP (1 mg / ml in acqua) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e lasciarlo riposare per 10 minuti a temperatura ambiente aFormare il complesso. NOTA: Le soluzioni NGF e protamina sono state sottoposte a aliquota e conservate a -20 ° C. Il congelamento e lo scongelamento ripetuti non sono raccomandati per lo stock NGF. </li><li> Aggiungere 59 μl di PC, 11 μL di SM, 4 μL di PS, 15 μL di CO e 45 μL di TPGS in una fiala di vetro. Mescolare ed evaporare l&#39;etanolo sotto un flusso nitrico di azoto per circa 5 min; Tutti gli eccipienti devono formare una pellicola sottile e grassa in fondo alla fiala di vetro. </li><li> Aggiungere 1 ml di acqua ultrapure (tipo 1) alla fiala e omogeneizzare a 9.500 giri / min (8.600 xg) per 5 minuti a temperatura ambiente per formare i prototipi NP. </li><li> Aggiungere il complesso preparato al punto 1.2 al NP prototipo e incubare a 37 ° C per 30 minuti con agitazione utilizzando una piccola barra di agitazione nel flaconcino di vetro. <ol><li> Raffreddare i NP in modo da agitare a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Dopo questo raffreddamento, aggiungere 106 μL di Apo AI (1,49 mg / ml) e mescolare a temperatura ambiente per una notte per formare la finaleNGF NPN che imitano HDL. </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione di nanoparticelle NGF HDL-imitanti <ol><li> Misurare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta utilizzando un analizzatore di particelle (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Utilizzare una colonna cromatografica di filtrazione a gel agarosio reticolato per separare il NGF scaricato dai NP NPM NGF HDL e determinare l&#39;efficienza di intrappolamento del NGF. <ol><li> Per la preparazione della colonna, trasferire 15 ml di sospensione di Sepharose 4B-CL in un bicchiere da 50 ml. Mescolare la sospensione del tallone utilizzando una barra di vetro e versare un po &#39;in una colonna (30 cm di lunghezza × 1 cm di diametro, con una fetta di vetro in basso). Toccare delicatamente la colonna per eliminare le bolle. Lasciare che il solvente venga scaricato e le perle si stabiliscano per qualche minuto. </li><li> Continua ad aggiungere la sospensione rimanente. Sciacquare la parete interna della colonna per pulire le perle. Scaricare il solvente finché il livello del solvente è leggermente aBove la parte superiore della fase stazionaria. Lavare e condizionare la colonna con 20 ml di soluzione salina fosfato tamponata 1x (PBS, contenente 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 e 2 mM KH 2 PO 4 ). </li><li> Per determinare le frazioni contenenti NGF scaricate, caricare 200 μL di soluzione NGF (10 μg / mL) sulla colonna di filtrazione gel (25 cm di lunghezza x 1 cm di diametro) e eluire con 1x PBS. </li><li> Raccogliere un totale di 12 frazioni (1 mL per ciascuna frazione) e misurare la concentrazione di NGF in ciascuna frazione utilizzando un kit Sandwich ELISA per NGF. </li><li> Rileva NGF dalle frazioni da 6 a 10 utilizzando il kit Sandwich ELISA. Ottenere un cromatogramma di NGF scaricato sulla colonna. Lavare la colonna con 20 ml di PBS. </li><li> Per determinare le frazioni contenenti NPs NGF HDL-imitanti, caricare 200 μL dei NP sulla colonna e eluire con 1x PBS. Raccogliere un totale di 12 frazioni (1 mL per ogni frazione) e misurare l&#39;intensità delle particelle in ogni frazione uCantare l&#39;analizzatore di particelle. Rileva i NP NGF dalle frazioni da 2 a 4. NOTA: L&#39;intensità è un parametro misurato dall&#39;analizzatore delle particelle, che indica quante nanoparticelle possono esistere nella soluzione di prova. Più NP esistono in soluzione, maggiore è l&#39;intensità. Con questo approccio, possiamo confermare che la colonna può separare NGF NP da NGF non scaricato. </li><li> Per misurare l&#39;efficienza di entrapamento di NGF, caricare 200 μl di NPG NGF HDL-imitanti sulla colonna e eluire con 1x PBS. Raccogliere complessivamente 12 frazioni (1 mL per ogni frazione). </li><li> Misurare la concentrazione NGF scaricata dalle frazioni da 6 a 10 usando il kit Sandwich ELISA. </li><li> Aggiungere le quantità NGF misurate fra le frazioni da 6 a 10 come NGF scaricato e calcolare l&#39;efficienza di entrapimento di NGF utilizzando la seguente equazione. % EE = (1 - scaricato NGF / totale NGF aggiunto in NP) x 100% equazione (1) </li></ol></li></ol> 3. In Vitro Release di NGF HDL-mimicking Nanoparticles <ol><li> Studiare in parallelo NGF (10 μg / mL in acqua, n = 4) e NGF HDL-imitanti NP (10 μg / mL; n = 4). </li><li> Pre-trattare 8 tubi di dialisi (cutoff di peso molecolare: 300 kDa) seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Preparare 5% di albumina bovina del siero (BSA) in PBS come mezzo di rilascio. Aggiungere 30 ml di mezzo di rilascio a un tubo da centrifuga da 50 ml e scaldare fino a 37 ° C in un agitatore con una velocità di scuotimento a 135 giri / min. Inserire altri 50 ml di mezzo di rilascio nell&#39;evasatore per la sostituzione. </li><li> Aggiungere 400 μL di mezzo di rilascio nel tubo di dialisi e aggiungere rapidamente 200 μL del campione esaminato per ottenere un volume sufficiente per la dialisi. </li><li> Chiudere il tubo e mettere rapidamente il tubo di dialisi nel mezzo di rilascio (tubo di centrifuga). Ritirare rapidamente 100 μL del mezzo di rilascio dal tubo di dialisi esterno come campione per il tempo 0. Immediatamente mettere il campione in -20 ° C per ulteriori analisi. Aggiungere 100 μl di frescoImmettere il mezzo nel tubo di centrifuga per sostituire il campione ritirato. Avviare il timer. </li><li> A 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 e 72 h, prelevare 100 μL del mezzo di rilascio e sostituirlo con 100 μl di terreno fresco. Immediatamente mettere i campioni prelevati in -20 ° C per ulteriori analisi. </li><li> Dopo 72 h, estrarre tutti i campioni da -20 ° C e scongelarli a temperatura ambiente. Misurare le concentrazioni di NGF dei campioni di rilascio utilizzando il kit Sandwich ELISA. </li></ol> 4. Bioattività delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti (studio di crescita dei neuriti) <ol><li> Coltivano le cellule PC12 nel supporto RPMI-1640 integrato con 10% di siero di cavallo caldo inattivato, 5% di siero fetale bovino, 100 μg / mL di streptomicina e 100 unità / ml di penicillina. Mantenere le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C e con 5% CO 2 . </li><li> Quando le cellule raggiungono la confluenza di ~ 70-80%, rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule con 1x PBS (circa 2 ml per 10 cm &lt;Sup&gt; 2 superficie della coltura). Rimuovere la soluzione di lavaggio. Trypsinizzare le cellule con l&#39;aggiunta di 0,25% di soluzione Trypsin-EDTA (0,25% di trysina e 1 mM EDTA, 0,5 ml per superficie di coltura da 10 cm 2 ) nel pallone e incubare a 37 ° C fino a quando non vengono eliminate più cellule. </li><li> Aggiungere due volumi di terreno di coltura e spin giù a 180 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura. Filtrare le cellule attraverso un ago di 22 G, ½ pollici per rompere i cluster di cellule. </li><li> Distribuire le cellule ad un rapporto di 1: 3 in una nuova colonna di coltura cellulare. Dopo incubazione durante la notte, rimuovere le cellule PC12 non collegate. Lasciare che le cellule collegate rimangano per un&#39;ulteriore crescita. </li><li> Ripetere questa procedura per 3 passaggi per selezionare la sottocultura di PC12 che ha una forte proprietà di adesione. Preimballare una piastra a 6 pozzetti con 800 μL / pozzetto di collagene di tipo I di ratto (100 μg / ml). </li><li> Trypsinizzare le celle PC12 selezionate come descritto nel passaggio 4.2 e filtrarle attraverso una22 G, ½ pollici ago per rompere i cluster di cellule. Conte le cellule con un emocitometro. Seed le cellule durante la notte a una densità di 10.000 cellule / pozzetto nella piastra a 6 pozzetti pre-rivestiti nel punto 4.5 per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra. </li><li> Diluire il NGF (10 μg / mL) e NGF HDL-imitanti NPs (10 μg / mL) con il terreno di coltura (descritto al punto 4.1) per preparare concentrazioni di 0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 ng / mL. Rimuovere 2 mL di mezzo da ogni pozzetto e sostituire con 2 mL di NGF liberi diluiti NGF o NGF HDL-imitanti NP. Cultura per 4 giorni. </li><li> Il giorno 4, cambiare il mezzo medio al fresco (descritto nel punto 4.1) contenente il trattamento corrispondente e proseguire il trattamento per altri 3 giorni. </li><li> Il giorno 7, visualizza le cellule con un microscopio leggero invertito e immagine ogni pozzetto a punti casuali sotto l&#39;ingrandimento di 10 volte. </li></ol> 5. Biodistribuzione delle nanoparticelle NGF HDL-imitanti <ol><li> Usi i topi adulti BALB / c (maschio, 25-30 g) a tEst la distribuzione dei tessuti dei NP NGF. Ridurre a caso i topi in tre gruppi di 3 topi per gruppo. Utilizzare un contenitore a forma di cono ( ad esempio, decapicone) per trattenere un topo e strofinare la coda con etanolo per promuovere la vasodilatazione e la visibilità della vena. </li><li> Iniettare 100 μL di NPs nocivi, NGF liberi o NGF HDL, a ciascun gruppo di topi (3 gruppi) attraverso le vene della coda ad una dose di 40 μg / kg di NGF. Usare un ago da 30,5 G attaccato ad una siringa da 1 ml. </li><li> A 30 minuti dopo l&#39;iniezione, anestetizzano i topi usando l&#39;isoflurano inalato del 3% (in ossigeno a portata di 2 L / min). Esegui una coda e un pizzico per determinare la profondità dell&#39;anestesia. Raccogliere il sangue per foratura cardiaca. <ol><li> Prendi circa 1 ml di sangue dal cuore. Eutanizzare ogni mouse dalla dislocazione cervicale. </li></ol></li><li> Mettere la carcassa del mouse in ricompensa dorsale. Aprire l&#39;addome utilizzando forbici chirurgiche e spostare grasso e intestino da parteUtilizzando un tampone di cotone per esporre il fegato, la milza e il rene. Raccogliere questi tessuti e sciacquarli in 1x PBS per pulire il sangue. </li><li> Centrifugare immediatamente i campioni di sangue a 3.400 xg e 4 ° C per 5 minuti per ottenere il plasma. Conservare il plasma ei tessuti a -80 ° C fino alle analisi. </li><li> Per analizzare i campioni di tessuto, spostare i campioni da -80 ° C a 4 ° C e sospendere 100 mg di campione di tessuto in un volume di 10 volte di tampone di estrazione (0,05 M di sodio acetato, 1,0 M di cloruro di sodio, 1% di tritone X-100, 1% BSA, 0,2 mM fenilmetanesolfonilfluoruro e 0,2 mM benzetonio cloruro). Homogenizzare a 10.000 giri / min e 4 ° C per 5 min. </li><li> Sacrificare due topi non trattati per raccogliere plasma e tessuti vuoti, come descritto nei passaggi 5.3 e 5.4. Preparare soluzioni standard NGF usando omogenei in polvere vuota o in tessuto vuoto. </li><li> Determinare le concentrazioni di NGF nei homogenati del plasma e del tessuto utilizzando il kit Sandwich ELISA, come sopra descritto. </li></ol>

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G., F&#246;rtsch, V., Hodler, G., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+characterization+of+a+reconstituted+high+density+lipoprotein+for+therapeutic+applications.">Production and characterization of a reconstituted high density lipoprotein for therapeutic applications.</a> Vox Sang. 71 (3), 155-164 (1996).</li><li>Zhang, Z., Chen, J., Ding, L., Jin, H., Lovell, J. F., Corbin, I. R., Cao, W., Lo, P. C., Yang, M., Tsao, M. S., Luo, Q., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDL-mimicking+peptide-lipid+nanoparticles+with+improved+tumor+targeting.">HDL-mimicking peptide-lipid nanoparticles with improved tumor targeting.</a> Small. 6 (3), 430-437 (2010).</li><li>Kim, Y., Fay, F., Cormode, D. P., Sanchez-Gaytan, B. L., Tang, J., Hennessy, E. 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Gli autori non hanno niente da rivelare.

In questo studio dimostriamo un metodo semplice per preparare NPs imitanti HDL per l&#39;incapsulamento di NGF. Sono stati studiati diversi sistemi di erogazione di NP per fornire proteine. Attualmente, molti preparati NP coinvolgono la dialisi, la precipitazione dei solventi e l&#39;idratazione del film. Questi processi sono generalmente complessi e impegnativi in ​​termini di scalabilità. Durante questo sviluppo di NP, è stato determinato che i lipidi avevano una forte adesione alla parete di vetro del contenito...

Macromolecole, come proteine, peptidi e acidi nucleici, stanno emergendo come farmaci promettenti e hanno guadagnato una notevole attenzione negli ultimi decenni 1 , 2 . A causa della loro elevata efficacia e modalità di azione specifica, essi presentano un grande potenziale terapeutico per i trattamenti del cancro, della malattia immunitaria, dell&#39;HIV e delle condizioni correlate 3 , 4 . Tuttavia, le proprietà fisiochimiche, come la loro grande dimensione molecolare, la struttura tridimensionale, le cariche superficiali e la natura idrofila, rendono la consegna in vivo di queste macromolecole molto impegnative. Ciò ostacola notevolmente il loro uso clinico 4 . Recenti progressi nei sistemi di erogazione di farmaci, come microparticelle, nanoparticelle polimeriche (NP), liposomi e NPs lipidi, hanno superato queste sfide e migliorato significativamente la distribuzione in vivo di macromolecole. HoTuttavia, sono stati rivelati alcuni inconvenienti riguardanti questi carichi di consegna, tra cui la scarsa capacità di caricamento del farmaco, l&#39;efficienza di scarsa entrapment, l&#39;emivita breve, la perdita di bioattività e gli effetti collaterali indesiderati 5 , 6 , 7 , 8 . Sistemi di trasporto efficaci rimangono un&#39;area di interesse di ricerca. Inoltre, lo sviluppo di metodi analitici per caratterizzare NPs caricati da droga è più impegnativo per le macromolecole che per le piccole molecole. La lipoproteina ad alta densità (HDL) è un NP naturale composto da un nucleo lipidico rivestito da apolipoproteine ​​e da un monosilofo fosfolipido. L&#39;HDL endogeno svolge un ruolo fondamentale nel trasporto di lipidi, proteine ​​e acidi nucleici attraverso la sua interazione con i recettori target, come SR-BI, ABCAI e ABCG1. È stato esplorato come veicolo per la consegna di diversi agenti terapeutici 9, 10 , 11 , 12 . Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. La dialisi è un approccio popolare. In questo metodo, i NP sono formati dall&#39;idratazione di un film lipidico utilizzando la soluzione di colato di sodio. Il sale viene quindi rimosso attraverso una dialisi di 2 giorni con tre tamponi 13 . I metodi di sonicazione fabbricano NP facendo subire una miscela lipidica per 60 min sotto una condizione di riscaldamento; I NP sono ulteriormente purificati mediante gel cromatografia 14 . La microfluidica genera NP attraverso un dispositivo microfluidico che mescola le soluzioni di fosfolipidi e apolipoproteine ​​AI (Apo AI) creando microvortici in un modello di messa a fuoco 15 . Chiaramente, questi metodi possono richiedere molto tempo, duri e difficili per la scala industriale. In questo articolo introdurremo la preparazione e la caratterizzazione di nuovi NPs imitanti HDL per il nervoL&#39;incapsulamento del fattore di crescita (NGF). NGF è un omodimero di polipeptidi legato al disolfuro contenente due monomeri di polipeptidi di 13,6 kDa. È stata sviluppata una nuova procedura per la preparazione dei NP mediante omogeneizzazione, seguita dall&#39;incapsulamento di NGF nei NP. I NP NPN di NGF sono stati caratterizzati per dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, potenziale zeta e rilascio in vitro . La loro bioattività è stata valutata per la crescita del neurite nelle cellule PC12. La biodistribuzione di NPs NGF HDL-imitanti è stata confrontata con quella di NGF libera dopo l&#39;iniezione endovenosa nei topi.

<table><tbody><tr><td>Recombinant Human Beta-NGF</td><td>Creative Biomart</td><td>NGF-05H</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Phosphatidylcholine (PC)</td><td>Avanti</td><td>131601P</td><td>95%, Egg, Chicken</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (SM)</td><td>Avanti</td><td>860062P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Phosphatidylserine (PS)</td><td>Avanti</td><td>840032P</td><td>Brain, Porcine</td></tr><tr><td>Cholesteryl oleate (CO)</td><td>Sigma</td><td>C9253</td><td></td></tr><tr><td>D-&amp;alpha;-Tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS)</td><td>BASF</td><td>9002-96-4</td><td>Vitamin E Polyethylene Glycol Succinate</td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>meets USP testing specifications</td></tr><tr><td>Apolipoprotein A1, Human plasma</td><td>Athens Research &amp;amp; Technology</td><td>16-16-120101</td><td>1 mg in 671 &amp;micro;L 10 mM NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>Sepharose 4B-CL</td><td>Sigma</td><td>CL4B200</td><td>Cross-linked agarose,&amp;nbsp; gel filtration chromatography column filling material</td></tr><tr><td>Sandwich ELISA Kit for NGF</td><td>R&amp;amp;D system</td><td>DY008</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30096.02</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>PC12 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>31414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzethonium chloride</td><td>Sigma</td><td>B8879</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Tekmar</td><td>T 25-S1</td><td></td></tr><tr><td>Delsa Nano HC particle analyzer</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Delsa Nano HC</td><td></td></tr><tr><td>Float-A-Lyzer G2 Dialysis Device</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>G235036</td><td>Molecule Cutoff 300 kDa</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendoff</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Kinematica</td><td>PT 1200C</td><td></td></tr><tr><td>DecapiCone</td><td>&amp;nbsp;Braintree Scientific Inc.</td><td>DC-M200</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and characterization of novel hdl-mimicking nanoparticles for nerve growth factor encapsulation

L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di introdurre metodi di preparazione e caratterizzazione per le nanoparticelle (NP) di carico di NFF-caricato, ad alta densità, lipoproteine ​​(HDL). Le HDL sono NPs endogene e sono state esplorate come veicoli per la consegna di agenti terapeutici. Sono stati sviluppati diversi metodi per preparare NPs che imitano HDL. Tuttavia, sono generalmente complicate, richiedono molto tempo e sono difficili per la scala industriale. In questo studio, l&#39;omogeneizzazione in un passo è stata usata per mescolare gli eccipienti e formare i prototipi NP. NGF è una proteina solubile in acqua di 26 kDa. Per facilitare l&#39;incapsulamento di NGF nell&#39;ambiente lipidico dei NP NPN che imitano HDL, la protamina USP è stata usata per formare un complesso di ioni-coppia con NGF per neutralizzare le cariche sulla superficie NGF. Il complesso NGF / protamina è stato quindi introdotto nei prototipi NP. Apolipoproteina AI è stata finalmente ricoperta sulla superficie dei NP. NGF HDL-imitando NP hanno mostrato preferibili proprietà in terminiS di dimensione delle particelle, distribuzione delle dimensioni, efficienza di entrapment, rilascio in vitro , bioattività e biodistribuzione. Con l&#39;accurata progettazione e l&#39;esplorazione dell&#39;omogeneizzazione in NPs che imitano HDL, la procedura è stata notevolmente semplificata e gli NP sono stati resi scalabili. Inoltre, sono state superate diverse sfide, come la separazione di NGF scaricati dai NP, che conduce affidabili studi di rilascio in vitro e misurando la bioattività dei NP.

Nella figura 1 è mostrato lo schema di ingegnerizzazione dei NPs NGF rivestiti con α-tocoferolo emulsionati in HDL preparati da una strategia di ioni-coppia. Per neutralizzare le cariche superficiali di NGF, la protamina USP è stata usata come agente di ioni-coppia per formare un complesso con NGF. Per proteggere la bioattività, sono stati progettati prototipi NPs che imitano HDL, in primo luogo utilizzando l&#39;omogeneizzazione; Quindi il complesso NGF / protamina ...

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Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

L&#39;omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine ​​per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo.

Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l&#39;incapsulamento del fattore di crescita del nervo

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

preparation-characterization-novel-hdl-mimicking-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.3K Views.  University of North Texas Health Science Center.  L'omogeneizzazione semplice è stata usata per preparare nanoparticelle nuove, ad alta densità, che simulano lipoproteine ​​per incapsulare il fattore di crescita del nervo. Le sfide, i protocolli dettagliati per la preparazione di nanoparticelle, la caratterizzazione in vitro e gli studi in vivo sono descritti in questo articolo. 

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Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1&#945; (Stromal cell-derived factor-1&#945;), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1&#945;-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1&#945; is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1&#945;, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1&#945; from the nanoparticles.

Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

Ricerca

Chimica

Electrospinning Growth Factor Releasing Microspheres into Fibrous Scaffolds

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth. This system incorporates mechanical, topographical, adhesive and chemical signals. Mechanical properties are controlled by the type of material used to fabricate the electrospun fibers. In this protocol we use 30% methacrylated Hyaluronic Acid (HA), which has a tensile modulus of ~500 Pa, to produce a soft fibrous scaffold. Electrospinning on to a rotating mandrel produces aligned fibers to create a topographical cue. Adhesion is achieved by coating the scaffold with fibronectin. The primary challenge addressed herein is providing a chemical signal throughout the depth of the scaffold for extended periods. This procedure describes fabricating&#160;poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres that contain Nerve Growth Factor (NGF) and directly impregnating the scaffold with these microspheres during the electrospinning process. Due to the harsh production environment, including high sheer forces and electrical charges, protein viability is measured after production. The system provides protein release for over 60 days and has been shown to promote primary nerve cell growth.

This protocol combines electrospinning and microspheres to develop tissue engineered scaffolds to direct neurons. Nerve growth factor was encapsulated within PLGA microspheres and electrospun into Hyaluronic Acid (HA) fibrous scaffolds. The protein bioactivity was tested by seeding the scaffolds with primary chick Dorsal Root Ganglia and culturing for 4-6 days.

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

This procedure describes a method to fabricate a multifaceted substrate to direct nerve cell growth.  This system incorporates mechanical, topographical, ...

Bioingegneria

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes. The emergence of prion diseases in wildlife populations and their increasing threat to human health has led to increased efforts to find a treatment for these diseases. Recent studies have found numerous anti-prion compounds that can either inhibit the infectious PrPRes isomer or down regulate the normal cellular prion protein. However, most of these compounds do not cross the blood brain barrier to effectively inhibit PrPRes formation in brain tissue, do not specifically target neuronal PrPC, and are often too toxic to use in animal or human subjects. 
We investigated whether siRNA delivered intravascularly and targeted towards neuronal PrPC is a safer and more effective anti-prion compound. This report outlines a protocol to produce two siRNA liposomal delivery vehicles, and to package and deliver PrP siRNA to neuronal cells. The two liposomal delivery vehicles are 1) complexed-siRNA liposome formulation using cationic liposomes (LSPCs), and 2) encapsulated-siRNA liposome formulation using cationic or anionic liposomes (PALETS). For the LSPCs, negatively charged siRNA is electrostatically bound to the cationic liposome. A positively charged peptide (RVG-9r [rabies virus glycoprotein]) is added to the complex, which specifically targets the liposome-siRNA-peptide complexes (LSPCs) across the blood brain barrier (BBB) to acetylcholine expressing neurons in the central nervous system (CNS). For the PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA), the cationic and anionic lipids were rehydrated by the PrP siRNA. This procedure results in encapsulation of the siRNA within the cationic or anionic liposomes. Again, the RVG-9r neuropeptide was bound to the liposomes to target the siRNA/liposome complexes to the CNS. Using these formulations, we have successfully delivered PrP siRNA to AchR-expressing neurons, and decreased the PrPC expression of neurons in the CNS.

The goal of this protocol is to use cationic/anionic liposomes with a neuro-targeting peptide as a CNS delivery system to enable siRNA to cross the BBB. The optimization of a delivery system for treatments, like siRNA, would allow for more treatment options for prion and other neurodegenerative diseases.

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

Biochimica

<meta charset="utf8"></head><body>Nanoparticelle di ossido di ferro per la somministrazione di terapia guidata da immagini nel glioblastoma murino

Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies to GBM. Reported here is an image-guided, iron oxide-based therapeutic delivery nano platform capable of bypassing this physiological barrier by virtue of size and accumulating in the tumor region, delivering its payload. This 25 nm nano platform consists of crosslinked dextran-coated iron oxide nanoparticles labeled with Cy5.5 fluorescent dye and containing antisense oligonucleotide as a payload. The magnetic iron oxide core enables tracking of the nanoparticles through in vivo magnetic resonance imaging, while Cy5.5 dye allows tracking by optical imaging. This report details the monitoring of the accumulation of this nanoparticle platform (termed MN-anti-miR10b) in orthotopically implanted glioblastoma tumors following intravenous injection. In addition, it provides insight into the in vivo delivery of RNA oligonucleotides, a problem that has hampered the translation of RNA therapeutics into the clinic.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Terapie innovative contro il cancro con nanoparticelle di ossido di ferro per il trattamento del glioblastoma

The blood-brain barrier is a significant hurdle in the delivery of therapies for glioblastoma, a disease for which there is no cure. Here, we report an in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform that can bypass this physiological barrier by virtue of size and accumulate in the tumor.

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive form of primary brain malignancy for which there is no cure. The blood-brain barrier is a ...

Ricerca sul cancro

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive properties of in vitro transcribed (IVT) mRNA. With the help of IVT mRNA, the de novo synthesis of a desired protein can be induced without changing the physiological state of the target cell. Moreover, protein biosynthesis can be precisely controlled due to the transient effect of IVT mRNA.
For the efficient transfection of cells, nanoliposomes (NLps) may represent a safe and efficient delivery vehicle for therapeutic mRNA. This study describes a protocol to generate safe and efficient cationic NLps consisting of DC-cholesterol and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) as a delivery vector for IVT mRNA. NLps having a defined size, a homogeneous distribution, and a high complexation capacity, and can be produced using the dry-film method. Moreover, we present different test systems to analyze their complexation and transfection efficacies using synthetic enhanced green fluorescent protein (eGFP) mRNA, as well as their effect on cell viability. Overall, the presented protocol provides an effective and safe approach for mRNA complexation, which may advance and improve the administration of therapeutic mRNA.

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

Here we describe a protocol for the generation of cationic nanoliposomes, which is based on the dry-film method and can be used for the safe and efficient delivery of in vitro transcribed messenger RNA.

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Progettazione di film di silicio poroso come elementi portanti del fattore di crescita del nervo

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Preparazione e caratterizzazione di novel nanoparticelle che imitano HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita del nervo

Riepilogo

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Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

Electrospinning Growth Factor Releasing Microsfere in Fibrosi Ponteggi

La consegna dei terapeutica siRNA al SNC Utilizzando cationici e anionici liposomi

Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

Formulazione e caratterizzazione di agenti bioattivi contenenti nanodischi

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Consegna di nanoparticelle di un carico utile di oligonucleotidi in un modello animale multiforme di glioblastoma

Generazione di nanoliposomi cationici per la consegna efficiente In Vitro di trascritti di RNA messaggero

Progettazione di film di silicio poroso come elementi portanti del fattore di crescita del nervo