Questo protocollo fornisce linee guida passo-passo per una via di accesso riproducibile alle regioni di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. Questa tecnica aumenta la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. Questa tecnica è stata e può essere applicata ad altri modelli animali.
Il Dr.Veronique VanderHorst, professore associato di neurologia e ricercatore principale del VanderHorst Laboratory, dimostrerà questa procedura. Assicurarsi che il flusso di ossigeno sia diretto al cono del naso. Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile.
Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari. Posizionare il lubrificante sugli occhi. Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90 gradi guidando manualmente il naso.
Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti della barra auricolare dell'adattatore del mouse parallela ai pilastri con la parte piatta del cranio che funge da riferimento. Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse e assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati parallelamente al tavolo sollevando il corpo con una piccola scatola. Posiziona un drappo sotto il corpo.
Iniettare una singola dose di quattro milligrammi per chilogrammo Meloxicam a rilascio lento per via sottocutanea ad un volume di due microlitri per grammo di peso corporeo. Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione alla betaina e poi di nuovo con un tampone per la preparazione dell'alcol e lasciarlo asciugare. Disinfettare le mani e indossare guanti sterili, quindi posizionare un drappo nel sito chirurgico.
Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale. Ridurre l'isoflurano per mantenere i livelli a 2.0. Fai un'incisione da uno a 1,2 centimetri con una lama chirurgica da 10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.
Fai con attenzione un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio, esponendo i muscoli della capite longus accoppiati. Posizionare entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare la pance sinistra e destra del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite dove la linea mediana è facilmente visibile.
Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale e poi continua attraverso la dura madre fino all'atlante. Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati. Utilizzare la pinza per laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona visione del tronco cerebrale e del cervelletto.
Ripetere la procedura di cui sopra, se necessario, fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale appaiono sotto la dura. Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli filamenti di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale fino a quando non vi è una chiara visione del tronco cerebrale, creando più spazio laterale. Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta.
Utilizzare la pinza angolata per afferrare la dura che si estende dall'osso occipitale all'atlante, quindi utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura di circa 0,5-1,5 millimetri nella dura. Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta Q sterile. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel quarto ventricolo, è il punto zero standard anteriore-posteriore e mediolaterale.
Posizionare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico. Abbassare il braccio della dorsale sulla superficie dorsale che si forma dal punto zero dorsoventrale. Quindi abbassare la pipetta sul tronco cerebrale e iniettare la soluzione.
Lasciare l'ago in posizione da uno a cinque minuti dopo l'iniezione per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra tre e 50 nanolitri. Quindi sollevare la pipetta o la siringa usando il braccio stereotassico e ripetere questo per più bersagli. Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico.
I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture. Chiudere la pelle con 3 suture in nylon o polipropilene.
L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. Nei topi, strutture come il nucleo ipoglosso, il gruppo respiratorio ventrale e la formazione reticolare adiacente nel tronco cerebrale caudale sono state regolarmente prese di mira utilizzando l'approccio cisterna magna come illustrato qui per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale. Al fine di determinare l'accuratezza dell'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard, è stata misurata la distanza tra i siti bersaglio previsti ed effettivi nei piani anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale per le regioni ventrale e dorsale.
I risultati mostrano errori significativamente più piccoli nei piani anteroposterior, mediolaterale e dorsoventrale rispetto all'approccio standard, evidenziando la maggiore precisione dell'approccio cisterna magna per questi obiettivi. Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale assicurarsi che l'anteroflessione della testa e l'elevazione del corpo vengano eseguite come descritto. Successivamente, è importante riconoscere i punti di riferimento chiave prima di manipolare il muscolo o la dura madre.
Se questi punti di riferimento non vengono riconosciuti o se vengono persi, sarà difficile rimanere orientati ed eseguire la procedura come previsto. Questa tecnica ha aiutato ad affrontare questioni concettuali relative all'organizzazione anatomica funzionale all'interno del tronco cerebrale caudale e del cordone cervicale superiore.
