Questi protocolli sono progettati per capire come i neutrofili umani interagiscono e uccidono i biofilm batterici. L'obiettivo è quello di comprendere meglio questo e di limitare la variabilità da saggio a saggio, comprendendo che ci sono problemi intrinseci con i neutrofili umani da donatore a donatore. Le tecniche qui elencate sono state ottimizzate per consentire agli utenti di eseguire esperimenti con una variabilità minima, in particolare con biofilm liberamente attaccati.
Inoltre, questi protocolli possono anche essere adattati per studiare altri microbi che possono formare biofilm. Inizia ottenendo colonie isolate di Staphylococcus aureus da uno stock crioconservato usando una tecnica di piastra striata su una piastra di agar ricca di sostanze nutritive, come l'agar di soia triptico. Rivestire i singoli pozzetti di una piastra da 96 pozzetti con 100 microlitri di PLL diluito in acqua sterile e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Aspirare la soluzione PLL in modo asettico utilizzando una trappola di aspirazione assistita da vuoto. Lasciare asciugare i pozzetti durante la notte a temperatura ambiente. Preparare una coltura durante la notte inoculando una colonia di S.aureus in MEM-alfa integrata con glucosio al 2% e incubata a 37 gradi Celsius per 16-18 ore a 200 rotazioni al minuto.
Diluire la coltura durante la notte trasferendo 50 microlitri a cinque millilitri di MEM-alfa fresco integrato con glucosio al 2%. Quindi incubarlo a 37 gradi Celsius a 200 rotazioni al minuto fino a raggiungere la fase logaritmica centrale. Utilizzare MEM-alfa per normalizzare la coltura mid-logaritmica a un OD di 0,1.
Trasferire 150 microlitri di coltura normalizzata in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti trattata con PLL. Incubare la piastra in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 18-20 ore. Aspirare il surnatante per rimuovere le cellule planctoniche.
Lavare delicatamente la biomassa rimanente con 150 microlitri di HBSS per rimuovere le cellule non attaccate. Ripetere almeno due volte per rimuovere tutte le cellule planctoniche. Aggiungere 100 microlitri di siero umano normale al 20% diluito in HBSS goccia a goccia al biofilm lavato e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti per opsonizzare il biofilm.
Aspirare la soluzione di siero e lavare i biofilm a goccia con 150 microlitri di HBSS. Aspirare l'HBSS, lasciando dietro di sé pozzi con biofilm opsonizzati. Aggiungi luminolo ai neutrofili risospesi in HBSS per formare una concentrazione finale di cinque micromolari luminoli.
Questa soluzione è pronta all'uso per i gruppi A e C.Aggiungere neutrofili miscelati con luminolo ai pozzetti con biofilm opsonizzati. Per il gruppo D, preparare una soluzione di luminolo a 50 micromolari in HBSS in una provetta separata senza neutrofili e aggiungerla al pozzetto contenente il biofilm. Aliquot 350 microlitri di neutrofili miscelati con luminolo e aggiungere PMA ad una concentrazione finale di 500 nanogrammi per millilitro alla miscela.
Per il gruppo B, aggiungere i neutrofili di questa miscela in pozzetti senza biofilm. Questo serve come controllo positivo. Centrifugare la piastra a 270 RCF per 30 secondi a quattro gradi Celsius.
Assicurarsi che il lettore di piastre sia impostato su 37 gradi Celsius, la luminescenza e la lettura cinetica per 60 minuti con intervalli di tre minuti. Posizionare la piastra nel lettore di piastre per misurare la produzione di ROS da parte dei neutrofili per 60 minuti. Utilizzare un ceppo fluorescente di S.aureus, come USA300, che esprime GFP per facilitare l'imaging al microscopio.
Incubare neutrofili con 100 micromolari BCD per 30 minuti in un rocker a 37 gradi Celsius con anidride carbonica atmosferica al 5%. Assicurarsi che i campioni siano incubati al buio e limitare l'esposizione alla luce. Per lavare i GAV in eccesso, centrifugare i neutrofili a 270 RCF per cinque minuti e aspirare il surnatante.
Ri-sospendere i neutrofili in HBSS fresco. Quindi aggiungere l'omodimero-1 di etidio ai neutrofili colorati con BCD ad una concentrazione finale di quattro micromolari per monitorare la morte dei neutrofili e batterica. Lavare il biofilm con HBSS e aggiungere 150 microlitri di neutrofili al biofilm di S.aureus che è stato coltivato in microvetrini.
Incubare i microvetrini in camera umidificata per 30 minuti. Il numero di cellule batteriche sarà basato sulla conta cellulare ottenuta dalla placcatura del biofilm di 18 ore. Immagina l'interazione del biofilm dei neutrofili usando canali fluorescenti corrispondenti a coloranti fluorescenti o lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione delle proteine.
I terreni di crescita batterica hanno ridotto al minimo la vitalità dei neutrofili a circa il 60% dopo 30 minuti di periodo di incubazione. I terreni di coltura cellulare di mammifero, tuttavia, non hanno influenzato la vitalità dei neutrofili e possono anche supportare la crescita dei biofilm di S.aureus. I neutrofili trattati con PMA utilizzati come controllo hanno mostrato un aumento della produzione di ROS.
In assenza di biofilm, i neutrofili trattati con PMA hanno mostrato una robusta produzione di ROS. In presenza del biofilm di S.aureus, la produzione complessiva di ROS da parte dei neutrofili trattati con PMA è diminuita, mentre in assenza di PMA, i neutrofili si sono basati esclusivamente sulla loro interazione con il biofilm, riducendo ulteriormente la produzione di ROS. La microscopia fluorescente a largo campo ha rivelato che molti neutrofili erano localizzati sulla superficie mentre alcuni erano all'interno dei biofilm di S.aureus.
La maggior parte delle cellule di S.aureus che interagiscono con i neutrofili erano morte, mentre alcune sono rimaste in vita come determinato dalla colorazione LIVE/DEAD. I biofilm colorati con omodimero-1 di etidio hanno rivelato una frazione della popolazione morta di S.aureus all'interno del biofilm. L'effetto del lavaggio del biofilm e dei neutrofili dopo 30 minuti di incubazione per rimuovere i neutrofili non aderenti ha rivelato che circa il 33% dei neutrofili morti erano ancora attaccati al biofilm.
I protocolli qui elencati possono anche essere utilizzati per studiare ulteriormente altre funzionalità dei neutrofili, come la fagocitosi e la formazione di trappole extracellulari dei neutrofili quando i neutrofili incontrano i biofilm.
