Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consiglio svedese della ricerca (90293501, A0290401, A0290402), settimo programma quadro della Comunità europea nell&#39;ambito convenzione di sovvenzione n ° 602.699 (DIREKT), la Fondazione NovoNordisk, il Gurli e Edward Brunnberg Foundation, La terapia, vleugel Fondazione e Åke Wiberg Fondazione.

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani di prelievo venoso sistema aperto in approvazione presso il Ethical Review Board a Uppsala (Permesso n 2008/264). 1. Le celle semina <ol><li> Colture primarie di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a 37 ° C in 5% di CO 2 in fiasche T75 rivestiti con 1% di gelatina in PBS pH 7.4. </li><li> Rimuovere terreno di coltura da un pallone T75 contenente HUVEC (o altro tipo di cellule endoteliali umane primarie) e lavare le cellule con 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Staccare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml 0,25% tripsina-EDTA e incubazione per 2 - 3 min a 37 ° C. </li><li> Raccogliere cellule sciacquando il pallone con 9 ml di 10% FBS in PBS pH 7,4 e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare le cellule a 735 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere accuratamente il pellet cellulare in mezzo di crescita delle cellule endoteliali microvascolari (CE GMMV) e contare le cellule in una camera Bürker. Seed 21.000 cells / cm 2 in 1 pozzetti diapositive colture cellulari e incubare a 37 ° C. Il HUVEC sarà confluente dopo 1 - 2 giorni di coltura. Monitorare la morfologia cellulare e la confluenza quotidiana al microscopio ottico. </li></ol> 2. Preparazione di sangue intero <ol><li> Preparare tutte le superfici artificiali che verranno a contatto con il sangue con un doppio strato di eparina immobilizzata (CHS) secondo le istruzioni del produttore. Materiali rivestiti CHS protetti dalla polvere possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 6 mesi senza perdita di funzione. </li><li> Utilizzare venipuntura sistema aperto per prelevare il sangue da un donatore sano breve (&lt;30 min) prima di iniziare l&#39;esperimento camera endoteliale nel sangue. Coppia ago ipodermico (18 G x 50 mm) a CHS tubo in silicone rivestito (diametro interno 2 mm) prima di raccogliere accuratamente sangue in una provetta CHS rivestito 50 ml. Supplemento sangue con eparina non frazionata per raggiungere una concentrazione finale di 0,75 IU / ml. Mescolare il sangue delicatamente inverting il tubo di 2 - 3 volte. </li></ol> Modello 3. Sangue endoteliale Camera <ol><li> Realizzare camere di sangue (Figura 1A; vista dall&#39;alto) in acrilico polimetilmetacrilato (PMMA) costituito da due cilindri (altezza 8 mm di raggio 9 mm) che sono incollati a una diapositiva PMMA (25 x 75 mm). Montare i bordi dei cilindri rivolti verso l&#39;alto con O-ring di gomma per sigillare la camera di sangue contro i vetrini con cellule endoteliali coltivate (Figura 1B). Ruotare le camere di sangue collegati alla slitta coltura con cellule endoteliali successivamente in posizione verticale (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un puntale CHS rivestito di trasferire 1,5 ml di sangue in ogni CHS rivestiti camera facendo attenzione a non attivare il sangue. </li><li> Trasferire 1 ml di sangue in provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK 3 EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K 3 EDTA per la determinazione delle concentrazioni di proteine ​​plasmatiche iniziale utilizzandoun enzima legato Test immunoenzimatico (ELISA). Mescolare accuratamente il sangue e mantenere i tubi in ghiaccio. </li><li> Rimuovere le pareti di plastica delle colture cellulari vetrini in base alle istruzioni del produttore e con attenzione lavare le cellule in PBS pH 7.4. Assicurarsi di rimuovere in seguito quanto più liquido possibile dalle diapositive. Non lasciate che le cellule asciugare. </li><li> Posizionare il vetrino sopra le camere di sangue, con celle di fronte al sangue. Fissare la diapositiva posizionando un morsetto attorno alla camera di cellule endoteliali del sangue. Utilizzare uno scivolo di plastica per un sostegno supplementare per evitare la rottura del vetrino di coltura cellulare quando si posiziona il morsetto. </li><li> Fissare la camera di cellule endoteliali del sangue su una ruota in movimento (40 cm di diametro) posto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Ruotare ciascuna camera sulla ruota a 0,5 xg per 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, smontare la camera di cellule endoteliali del sangue. Lavare i vetrini di coltura cellulare in PBS pH 7.4 e fissare le cellule in ghiaccio freddo 1% paraformaldeide (PFA) fo 10 min. Trasferire 1 ml di sangue da ciascuna camera di provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK 3 EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K 3 EDTA e mescolare delicatamente le provette. Tenere le provette in ghiaccio. </li><li> Centrifugare le provette a 4560 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il plasma sanguigno a nuove provette da microcentrifuga e conservare in -70 ° C fino a quando ulteriori analisi. </li></ol> 4. Analisi del sangue endoteliale Interazioni <ol><li> Eseguire immunofluorescenza con il mouse CD16 anti-umano seguita da capra secondario anti-topo Alexa 488 e falloidina-TexasRed. Eseguire ogni fase di colorazione per 1 ora a temperatura ambiente e lavare i vetrini in PBS pH 7,4 tra ogni passo. Controcolorare i nuclei con DAPI per 10 min a temperatura ambiente. Analizzare emocomponenti legati alle cellule endoteliali mediante microscopia a fluorescenza in combinazione con analisi di immagine utilizzando adatto software di analisi di immagini come CellProfiler. </li><li> Quantify le reazioni nel vano di sangue con trombina-antitrombina (TAT) ELISA come da istruzioni dei campioni di plasma del produttore. </li><li> L&#39;uso di adeguati strumenti statistici, ad es., Un t test per dati non appaiati, per analizzare i dati. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Molteplici interazioni tra il sangue e parete del serbatoio sono normalmente mantenute in stato di quiescenza a causa della natura non adesivo e anti-trombotica dell&#39;endotelio. 7 In condizioni patologiche che coinvolgono l&#39;infiammazione, l&#39;endotelio viene attivato con un conseguente aumento dell&#39;espressione del recettore di adesione 8 e una ridotta capacità di inibire l&#39;emostasi. 9 Attivazione dei sistemi a cascata nel sangue, a sua volta amplifica la trombogenicità dell&#39;endotelio causando ulteriore trombosi e il reclutamento dei leucociti. 10 Per ottenere una migliore comprensione di questa delicata interazione tra cellule endoteliali e sangue intero, abbiamo sviluppato un nuovo metodo in vitro in cui cellule endoteliali coltivate sono posti a contatto con sangue intero. A nostra conoscenza, la nostra messa a punto è il primo a mostrare le cellule endoteliali incubate con tutto il sangue umano con nulla o molto poco anticoagulante per periodi di tempo più lunghi. nt &quot;&gt; La sensibilità di questo sistema è abilitato per venipuntura sistema aperto in combinazione con uno strato protettivo di eparina immobilizzata su tutte le superfici poste a contatto con il sangue. L&#39;uso di un sistema aperto durante il prelievo del sangue riduce l&#39;attivazione dei sistemi a cascata durante venipuntura pur consentendo l&#39;uso di una quantità autodeterminata di anticoagulante. tubi evacuati sangue disponibili in commercio possono, tuttavia, essere usati a seconda dei punti di estremità destinate dello studio. La concentrazione finale di anticoagulante aggiunto ai tubi sistemi chiusi più disponibili in commercio possono inibire sensibili e altrimenti difficili da studiare, interazioni nel setup. 6 Una superficie eparina protettiva elimina ulteriore attivazione del sangue attraverso il contatto di superficie con superfici diverse dalle cellule endoteliali. 5 Infatti, l&#39;incubazione di sangue intero addizionato con una piccola quantità di eparina non frazionata in Camera senza la protezione di CHS provocato formazione del coagulo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La bolla d&#39;aria all&#39;interno della camera permette miscelazione del sangue durante l&#39;incubazione con le cellule endoteliali. Per valutare l&#39;effetto della dimensione delle bolle d&#39;aria, sono stati utilizzati due differenti volumi di sangue. In questo modello, abbiamo misurato i livelli di TAT simili indipendentemente dalle dimensioni delle bolle d&#39;aria nelle camere incubate con HUVEC. TAT era, tuttavia, è aumentata con una dimensione più piccola bolla d&#39;aria nelle camere completamente CHS trattata. Questo, in conformità precedentemente descritte le proprietà delle cellule endoteliali 11, indica un effetto regolatore sulla maggiore attivazione della coagulazione fornite dalle cellule endoteliali che manca nella camera CHS inerte. La bolla d&#39;aria nel sistema crea un flusso alla rotazione della camera. La dimensione della bolla influenzerà le forze all&#39;interno di questo sistema di rotazione. Ciò è dimostrato dai nostri risultati nella Figura 2D fosse una bolla più piccola crea valori TAT più alti rappresentano una forza ridotta sul cioè sangue, il flusso di sangueentro la camera è minore e quindi l&#39;attivazione del sistema a cascata avviene in misura maggiore. Va ricordato che in questo sistema stiamo creando un flusso rotante che sarà diversa velocità attraverso la camera con la più alta velocità lungo le pareti e il basso al centro. Questo non è ovviamente un ambiente ottimale per quanto riguarda il flusso e sforzo di taglio per le cellule endoteliali, ma ancora abbiamo un sistema che produce risultati stabili e ripetibili. Ulteriori condizioni ottimali includerebbero circolanti flusso laminare in assenza di turbolenze. Questo, tuttavia, non è possibile nel modello rappresentato qui e alla nostra conoscenza un tale sistema non è ad oggi disponibili. Anche se, ci sono diversi sistemi microfluidici disponibili in commercio che non sono combinabili con sangue intero senza o con bassi livelli di anticoagulante aggiunto al sistema così sicuro da consentire un&#39;adeguata valutazione sensibile delle interazioni tra tutti i componenti presenti nel sangue e nelle cellule endoteliali. Inoltre, c&#39;è stato un aumento di 2 volte nel reclutamento di cellule del sangue verso TNFa attivato HUVEC in combinazione con una formazione raddoppiato di TAT indipendentemente dal volume del sangue. Ciò verifica stabilità del sistema modello e mostra anche la possibilità di utilizzare un endotelio attivato in combinazione con sangue intero. Future su, la camera di cellule endoteliali di sangue può essere usato per studiare il reclutamento di cellule del sangue verso le cellule endoteliali attivate da una varietà di marcatori espressi sulle cellule in varie condizioni e fasi di attivazione. Inoltre, il modello può essere utilizzato in combinazione con agenti farmacologici per valutare gli effetti sulle condizioni infiammatorie. In sintesi, si mostra il grande vantaggio di combinare un modello da camera con cellule del sangue e vascolari umane per creare un essere umano completo sistema in vitro per eseguire importanti indagini di malattia vascolare.

Metodi per l&#39;analisi delle interazioni sangue-vascolare nelle malattie cardiovascolari in genere comportano esperimenti di ricerca degli animali. Risultati creati in modelli animali sperimentali di ricerca possono, tuttavia, hanno poca o nessuna incidenza malattie umane. 1,2 Come tale, c&#39;è una necessità di una buona e affidabile in vitro per studiare le interazioni cellulari tra il compartimento sangue e cellule endoteliali vascolari un sistema simile a quella umana. Abbiamo quindi stabilito un modello di camera di cellule endoteliali del sangue. Questo si basa su un modello descritto precedentemente utilizzato per studiare le interazioni tra biomateriali e sangue umano intero. 3 Contrariamente alle altre configurazioni in vitro in cui il numero di componenti purificati, di solito limitati cioè, trombociti, leucociti e cellule endoteliali sono disponibili, la presente modello incorpora tutti componenti presenti in un vaso sanguigno. La messa a punto del endoteliale sangue cmodello di camera di ell è stato progettato per consentire l&#39;uso di sangue umano appena prelevato con poco o nessun anticoagulante aggiunto. Sangue conservato durante i periodi di tempo più lunghi acquisire nell&#39;ambito cosiddetti lesioni di stoccaggio in cui ripartizione degli eritrociti può interferire con delicate interazioni tra il sangue e le cellule endoteliali. 4 Per evitare la formazione di grumi durante la manipolazione di sangue intero ex vivo richiede elevate dosi di anticoagulanti o che tutto il materiale a contatto con il sangue deve essere non-attivazione. Come superfici non attivanti sono rari in ambiente di laboratorio, i materiali possono in alternativa essere dotati di uno strato protettivo di eparina immobilizzata. Uno strato protettivo di eparina immobilizzata (nel seguito indicato come superficie Corline eparina (CHS)), che può essere applicato alla maggior parte dei materiali che creano una superficie di contatto in cui il sangue può avvenire senza causare l&#39;attivazione della cascata coagulativa. 5 Quindi, fornendo le camere con CHS, il ce endoteliale sanguell modello di camera permette l&#39;uso di concentrazioni molto basse di anticoagulante nel sangue. Evitare l&#39;aggiunta di alte concentrazioni di anticoagulante nel modello endoteliale camera di sangue consente di studiare le interazioni sensibili all&#39;interno di un vaso sanguigno che altrimenti potrebbero essere mascherato. 6 Il modello di camera di cellule endoteliali del sangue è composto da due camere formate allegando cilindri di plastica (altezza: 8 mm; raggio: 9 mm) a un vetrino da microscopio in plastica. I bordi rivolti verso l&#39;alto sui cilindri sono dotati di scanalature che sono dotati di O-ring di gomma utilizzati per sigillare le camere contro la slitta coltura cellulare. Le camere sono solo parzialmente pieni di sangue come l&#39;aria rimasta nella camera mantiene il sangue in movimento quando le camere vengono successivamente ruotati in posizione verticale (Figura 1). Per valutare la funzionalità del modello, abbiamo eseguito esperimenti con entrambi completamente rivestita CHScamera o ombelicale umano Vena cellule endoteliali (HUVEC). Due volumi di sangue separati sono stati analizzati e la formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi (un indicatore indiretto della coagulazione) è stata misurata con enzyme linked test immunoenzimatico (ELISA). Abbiamo poi valutato l&#39;effetto dei volumi di sangue e il fattore di necrosi tumorale (TNF) stimolato le cellule endoteliali su reclutamento dei leucociti mediante analisi di immagine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figura 1. Configurazione del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Top disegno schematico della camera di sangue realizzato in PMMA. (B) primarie cellule endoteliali umane sono coltivati ​​su 1-e diapositive da camera. Fresco sangue umano intero è aggiunto due camere su un vetrino da microscopio. Le camere e tutti i materiali utilizzati per la manipolazione del sangue sono trattati con un rivestimento protettivo HS. Dopo aver rimosso le pareti della cell cultura scivolo, le cellule sono posti di fronte al sangue e il sistema è bloccato chiuso. camere cellule (C) La endoteliale sangue vengono poi incubate in rotazione 37 ° C. Successivamente, le reazioni nel comparto sangue possono essere analizzati mediante ELISA e le cellule endoteliali possono essere analizzate mediante microscopia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:91px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:272px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-12200</td>
			<td style="width:272px;">Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td>
			<td style="width:91px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-22120</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Gelatin</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G-2500</td>
			<td style="width:272px;">Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">TAT ELISA</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Lab.</td>
			<td style="width:119px;">TAT-EIA-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Mouse anti-human CD16</td>
			<td style="width:91px;">DAKO</td>
			<td style="width:119px;">F7011</td>
			<td>Dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse Alexa 488</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Phalloidin-Texas Red</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A22287</td>
			<td>Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:91px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td>Dilution 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E-6758</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Tecnologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:91px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10437</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1 well cell culture slides</td>
			<td style="width:91px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">354101</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Blood Chambers</td>
			<td style="width:91px;">NA</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:272px;">Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Clamps</td>
			<td style="width:91px;">Office Depot</td>
			<td style="width:119px;">2052204</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Corline Heparin Surface (CHS)</td>
			<td style="width:91px;">Corline Systems AB</td>
			<td style="width:119px;">945-00</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hypodermic needle</td>
			<td style="width:91px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-1850R</td>
			<td style="width:272px;">Size: 18 G x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Unfractionated Heparin (UFH)</td>
			<td style="width:91px;">Leo Pharma</td>
			<td style="width:119px;">585679</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">K3EDTA</td>
			<td style="width:91px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">1709958</td>
			<td style="width:272px;">Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">PFA</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Light microscope</td>
			<td style="width:91px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">TS100</td>
			<td style="width:272px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:91px;">Broad Institute</td>
			<td style="width:119px;">CellProfiler</td>
			<td style="width:272px;">Available for free at www.cellprofiler.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

La maggior parte delle malattie conosciute sono accompagnati da disturbi del sistema cardiovascolare. Studi sulla complessità dei percorsi interagenti attivate durante patologie cardiovascolari sono tuttavia limitati dalla mancanza di metodi robusti e fisiologicamente rilevanti. Per modellare eventi vascolari patologici abbiamo sviluppato un saggio in vitro per studiare l&#39;interazione tra endotelio e sangue intero. Il test consiste di cellule endoteliali umane primarie, che sono posti a contatto con il sangue umano intero. Il metodo utilizza sangue nativo con nessuna o pochissima anticoagulante, permettendo studio delle delicate interazioni tra componenti cellulari e molecolari presenti in un vaso sanguigno. Abbiamo studiato la funzionalità del dosaggio confrontando attivazione della coagulazione da diversi volumi di sangue incubate con o senza cellule endoteliali umane della vena ombelicale (HUVEC). Considerando che un volume di sangue più grande contribuito allaun aumento della formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi, presenza di HUVEC comportato ridotta attivazione della coagulazione. Inoltre, abbiamo applicato l&#39;analisi delle immagini di attaccamento dei leucociti a HUVEC stimolate con fattore di necrosi tumorale (TNF) e ha trovato la presenza di cellule CD16 + per essere significativamente più alto sul TNF stimolato cellule rispetto alle cellule non stimolate dopo il contatto con il sangue. In conclusione, il dosaggio può essere applicato per studiare le patologie vascolari, dove vengono perturbate interazioni tra l&#39;endotelio e il comparto sangue.

La necessità di CHS rivestimento Per misurare reazioni in sangue intero specifici a quelle sviluppate da cellule endoteliali, tutti i materiali utilizzati per la camera di cellule endoteliali sangue devono essere dotate di un rivestimento CHS prima dell&#39;uso. Figura 2A (sinistra) mostra una camera non rivestito dopo 30 min di contatto del sangue con un coagulo ben visibile presente. Trattare la camera con CHS (Figura 2A, destra) invece protegge il sangue dall&#39;attivazione incontrollata, assicurando che i risultati sono dovuti alle interazioni cellula-sangue endoteliali. L&#39;effetto del volume di sangue alla Camera L&#39;attivazione della coagulazione è più probabile nel sangue stagnante come la probabilità di interazione tra fattori della coagulazione attivati ​​aumenta. Nel modello camera di cellule endoteliali del sangue, il sangue viene tenuto in movimento a causa della circolazione di una bolla d&#39;aria all&#39;interno della camera. In order per determinare l&#39;effetto di variazioni del volume di sangue, e quindi anche dimensioni delle bolle d&#39;aria, una camera CHS rivestito è stato collegato ad un vetrino rivestito CHS che è stato testato con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue intero per 30 min. Il volume di sangue senza alcun movimento dalla bolla d&#39;aria è di 2,5 volte superiore se 1,75 ml di sangue viene aggiunto alla camera rispetto a quando 1,5 ml di sangue viene utilizzato (Figura 2B). I TAT-valori misurati suggerito un aumento TAT-formazione con un aumento del volume del sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) sono state incubate sia con 1,5 o 1,75 ml di sangue intero, nessuna differenza è stata osservata tra i due gruppi, suggerendo che le cellule endoteliali possono modulare l&#39;attivazione della coagulazione (Figura 2D). L&#39;effetto del TNF sulla reclutamento dei globuli e attivazione della coagulazione Al fine di studiare l&#39;effetto di TNF sulla reclutamento dei leucociti, HUVEC erano deliziaed con 20 ng / ml TNF 4 ore prima di contatto con il sangue. Contatto sangue - sia con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue - è stato continuato per 30 minuti dopo di che i vetrini di coltura sono state colorate per CD16 (Figura 2F), ripreso e il numero di cellule CD16 + è stato quantificato. Il reclutamento di cellule CD16 + è aumentato in modo significativo con il trattamento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 + cellule / mm 2 (p &lt;0,0001) con 1,5 ml di sangue e 172-378 (P &lt;0,0001) con 1,75 ml di sangue. La formazione di complessi TAT è stata misurata nei campioni plasmatici corrispondenti del sangue incubati con cellule sia TNFa trattati o non trattati (figura 2G). Cellule TNFa stimolato indotto un raddoppio approssimativo di complessi TAT rispetto alle cellule non trattate. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Ficoure 2: Funzionalità del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Camere con o senza CHS sono stati incubati con sangue intero. Senza CHS, un coagulo si è formato dopo 30 min. Misura della trombina-antitrombina (TAT) complessi, un indicatore indiretto della coagulazione del sangue, in incubate senza CHS era&gt; 6.000 mg / ml. (B) Il volume di sangue non mantenuto in movimento dalla bolla d&#39;aria in rotazione varierà con diversi volumi di sangue. Con l&#39;aggiunta di 1,5 ml di sangue, questo volume sarà 0,3 ml, mentre aumenterà a 0,74 ml con l&#39;aggiunta di 1,75 ml. (C) HUVEC ripreso con microscopia a contrasto di fase mostra tipica morfologia delle cellule endoteliali di un monostrato confluente prima valori TAT per camere completamente CHS rivestiti contatto con il sangue. (D) mostrano una leggera differenza quando vengono aggiunti diversi volumi di sangue. L&#39;aggiunta di 1,5 ml di sangue provocato 35 ± 11 mg / ml (n = 7) in confronto a 1,75 ml, che portano a 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Questa differenza non è più presente quando HUVEC sono incubati con gli stessi volumi di sangue; 66 ± 55 mcg / ml per 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 mcg / ml per 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificazione del numero di cellule CD16 + presenti su entrambi non stimolato o TNFa stimolato HUVEC dopo contatto con il sangue. Il numero di cellule CD16 + è significativamente aumentata con TNF stimolato cellule incubate sia con 1,5 ml (basale: 100 ± 40 cellule / mm; TNF: 256 ± 121 cellule / mm) o 1,75 ml (basale: 172 ± 67 cellule / mm; TNF: 378 ± 185 cellule / mm) di sangue intero (F) Immagini rappresentative della non stimolato e TNFa stimolato HUVEC colorate per falloidina (rosso), CD16 (verde) e DAPI (blu).. Barra di scala = 250 micron (G) La formazione di complessi TAT è approssimativamente raddoppiata TNFa stimolato cellule rispetto alle cellule non trattate incubate con il sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 volte più TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 volte più TAT, n = 4). Tutti i valori sono presentati come media ± deviazione standard; valori di p sono stati calcolati mediante test t spaiati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per lo studio delle interazioni tra l&#39;uomo di sangue intero e l&#39;endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.3K Views.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Ricorrente cheratite erpetica Stromal in Mouse, un modello per lo studio HSK umano

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Sviluppo e identificazione di una sottopopolazione romanzo di Human neutrofili di derivazione fagociti Giant<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...