Name: a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal Consiglio svedese della ricerca (90293501, A0290401, A0290402), settimo programma quadro della Comunità europea nell&#39;ambito convenzione di sovvenzione n ° 602.699 (DIREKT), la Fondazione NovoNordisk, il Gurli e Edward Brunnberg Foundation, La terapia, vleugel Fondazione e Åke Wiberg Fondazione.

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani di prelievo venoso sistema aperto in approvazione presso il Ethical Review Board a Uppsala (Permesso n 2008/264). 1. Le celle semina <ol><li> Colture primarie di cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a 37 ° C in 5% di CO 2 in fiasche T75 rivestiti con 1% di gelatina in PBS pH 7.4. </li><li> Rimuovere terreno di coltura da un pallone T75 contenente HUVEC (o altro tipo di cellule endoteliali umane primarie) e lavare le cellule con 2,1 mM EDTA in PBS pH 7,4. Staccare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml 0,25% tripsina-EDTA e incubazione per 2 - 3 min a 37 ° C. </li><li> Raccogliere cellule sciacquando il pallone con 9 ml di 10% FBS in PBS pH 7,4 e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. Centrifugare le cellule a 735 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere accuratamente il pellet cellulare in mezzo di crescita delle cellule endoteliali microvascolari (CE GMMV) e contare le cellule in una camera Bürker. Seed 21.000 cells / cm 2 in 1 pozzetti diapositive colture cellulari e incubare a 37 ° C. Il HUVEC sarà confluente dopo 1 - 2 giorni di coltura. Monitorare la morfologia cellulare e la confluenza quotidiana al microscopio ottico. </li></ol> 2. Preparazione di sangue intero <ol><li> Preparare tutte le superfici artificiali che verranno a contatto con il sangue con un doppio strato di eparina immobilizzata (CHS) secondo le istruzioni del produttore. Materiali rivestiti CHS protetti dalla polvere possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 6 mesi senza perdita di funzione. </li><li> Utilizzare venipuntura sistema aperto per prelevare il sangue da un donatore sano breve (&lt;30 min) prima di iniziare l&#39;esperimento camera endoteliale nel sangue. Coppia ago ipodermico (18 G x 50 mm) a CHS tubo in silicone rivestito (diametro interno 2 mm) prima di raccogliere accuratamente sangue in una provetta CHS rivestito 50 ml. Supplemento sangue con eparina non frazionata per raggiungere una concentrazione finale di 0,75 IU / ml. Mescolare il sangue delicatamente inverting il tubo di 2 - 3 volte. </li></ol> Modello 3. Sangue endoteliale Camera <ol><li> Realizzare camere di sangue (Figura 1A; vista dall&#39;alto) in acrilico polimetilmetacrilato (PMMA) costituito da due cilindri (altezza 8 mm di raggio 9 mm) che sono incollati a una diapositiva PMMA (25 x 75 mm). Montare i bordi dei cilindri rivolti verso l&#39;alto con O-ring di gomma per sigillare la camera di sangue contro i vetrini con cellule endoteliali coltivate (Figura 1B). Ruotare le camere di sangue collegati alla slitta coltura con cellule endoteliali successivamente in posizione verticale (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un puntale CHS rivestito di trasferire 1,5 ml di sangue in ogni CHS rivestiti camera facendo attenzione a non attivare il sangue. </li><li> Trasferire 1 ml di sangue in provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK 3 EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K 3 EDTA per la determinazione delle concentrazioni di proteine ​​plasmatiche iniziale utilizzandoun enzima legato Test immunoenzimatico (ELISA). Mescolare accuratamente il sangue e mantenere i tubi in ghiaccio. </li><li> Rimuovere le pareti di plastica delle colture cellulari vetrini in base alle istruzioni del produttore e con attenzione lavare le cellule in PBS pH 7.4. Assicurarsi di rimuovere in seguito quanto più liquido possibile dalle diapositive. Non lasciate che le cellule asciugare. </li><li> Posizionare il vetrino sopra le camere di sangue, con celle di fronte al sangue. Fissare la diapositiva posizionando un morsetto attorno alla camera di cellule endoteliali del sangue. Utilizzare uno scivolo di plastica per un sostegno supplementare per evitare la rottura del vetrino di coltura cellulare quando si posiziona il morsetto. </li><li> Fissare la camera di cellule endoteliali del sangue su una ruota in movimento (40 cm di diametro) posto in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Ruotare ciascuna camera sulla ruota a 0,5 xg per 30 min. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, smontare la camera di cellule endoteliali del sangue. Lavare i vetrini di coltura cellulare in PBS pH 7.4 e fissare le cellule in ghiaccio freddo 1% paraformaldeide (PFA) fo 10 min. Trasferire 1 ml di sangue da ciascuna camera di provette da microcentrifuga contenente 30 ml 0.34 MK 3 EDTA per raggiungere una concentrazione finale di 10 mM K 3 EDTA e mescolare delicatamente le provette. Tenere le provette in ghiaccio. </li><li> Centrifugare le provette a 4560 xg per 10 min a 4 ° C. Trasferire il plasma sanguigno a nuove provette da microcentrifuga e conservare in -70 ° C fino a quando ulteriori analisi. </li></ol> 4. Analisi del sangue endoteliale Interazioni <ol><li> Eseguire immunofluorescenza con il mouse CD16 anti-umano seguita da capra secondario anti-topo Alexa 488 e falloidina-TexasRed. Eseguire ogni fase di colorazione per 1 ora a temperatura ambiente e lavare i vetrini in PBS pH 7,4 tra ogni passo. Controcolorare i nuclei con DAPI per 10 min a temperatura ambiente. Analizzare emocomponenti legati alle cellule endoteliali mediante microscopia a fluorescenza in combinazione con analisi di immagine utilizzando adatto software di analisi di immagini come CellProfiler. </li><li> Quantify le reazioni nel vano di sangue con trombina-antitrombina (TAT) ELISA come da istruzioni dei campioni di plasma del produttore. </li><li> L&#39;uso di adeguati strumenti statistici, ad es., Un t test per dati non appaiati, per analizzare i dati. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Molteplici interazioni tra il sangue e parete del serbatoio sono normalmente mantenute in stato di quiescenza a causa della natura non adesivo e anti-trombotica dell&#39;endotelio. 7 In condizioni patologiche che coinvolgono l&#39;infiammazione, l&#39;endotelio viene attivato con un conseguente aumento dell&#39;espressione del recettore di adesione 8 e una ridotta capacità di inibire l&#39;emostasi. 9 Attivazione dei sistemi a cascata nel sangue, a sua volta amplifica la trombogenicità dell&#39;endotelio causando ulteriore trombosi e il reclutamento dei leucociti. 10 Per ottenere una migliore comprensione di questa delicata interazione tra cellule endoteliali e sangue intero, abbiamo sviluppato un nuovo metodo in vitro in cui cellule endoteliali coltivate sono posti a contatto con sangue intero. A nostra conoscenza, la nostra messa a punto è il primo a mostrare le cellule endoteliali incubate con tutto il sangue umano con nulla o molto poco anticoagulante per periodi di tempo più lunghi. nt &quot;&gt; La sensibilità di questo sistema è abilitato per venipuntura sistema aperto in combinazione con uno strato protettivo di eparina immobilizzata su tutte le superfici poste a contatto con il sangue. L&#39;uso di un sistema aperto durante il prelievo del sangue riduce l&#39;attivazione dei sistemi a cascata durante venipuntura pur consentendo l&#39;uso di una quantità autodeterminata di anticoagulante. tubi evacuati sangue disponibili in commercio possono, tuttavia, essere usati a seconda dei punti di estremità destinate dello studio. La concentrazione finale di anticoagulante aggiunto ai tubi sistemi chiusi più disponibili in commercio possono inibire sensibili e altrimenti difficili da studiare, interazioni nel setup. 6 Una superficie eparina protettiva elimina ulteriore attivazione del sangue attraverso il contatto di superficie con superfici diverse dalle cellule endoteliali. 5 Infatti, l&#39;incubazione di sangue intero addizionato con una piccola quantità di eparina non frazionata in Camera senza la protezione di CHS provocato formazione del coagulo. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; La bolla d&#39;aria all&#39;interno della camera permette miscelazione del sangue durante l&#39;incubazione con le cellule endoteliali. Per valutare l&#39;effetto della dimensione delle bolle d&#39;aria, sono stati utilizzati due differenti volumi di sangue. In questo modello, abbiamo misurato i livelli di TAT simili indipendentemente dalle dimensioni delle bolle d&#39;aria nelle camere incubate con HUVEC. TAT era, tuttavia, è aumentata con una dimensione più piccola bolla d&#39;aria nelle camere completamente CHS trattata. Questo, in conformità precedentemente descritte le proprietà delle cellule endoteliali 11, indica un effetto regolatore sulla maggiore attivazione della coagulazione fornite dalle cellule endoteliali che manca nella camera CHS inerte. La bolla d&#39;aria nel sistema crea un flusso alla rotazione della camera. La dimensione della bolla influenzerà le forze all&#39;interno di questo sistema di rotazione. Ciò è dimostrato dai nostri risultati nella Figura 2D fosse una bolla più piccola crea valori TAT più alti rappresentano una forza ridotta sul cioè sangue, il flusso di sangueentro la camera è minore e quindi l&#39;attivazione del sistema a cascata avviene in misura maggiore. Va ricordato che in questo sistema stiamo creando un flusso rotante che sarà diversa velocità attraverso la camera con la più alta velocità lungo le pareti e il basso al centro. Questo non è ovviamente un ambiente ottimale per quanto riguarda il flusso e sforzo di taglio per le cellule endoteliali, ma ancora abbiamo un sistema che produce risultati stabili e ripetibili. Ulteriori condizioni ottimali includerebbero circolanti flusso laminare in assenza di turbolenze. Questo, tuttavia, non è possibile nel modello rappresentato qui e alla nostra conoscenza un tale sistema non è ad oggi disponibili. Anche se, ci sono diversi sistemi microfluidici disponibili in commercio che non sono combinabili con sangue intero senza o con bassi livelli di anticoagulante aggiunto al sistema così sicuro da consentire un&#39;adeguata valutazione sensibile delle interazioni tra tutti i componenti presenti nel sangue e nelle cellule endoteliali. Inoltre, c&#39;è stato un aumento di 2 volte nel reclutamento di cellule del sangue verso TNFa attivato HUVEC in combinazione con una formazione raddoppiato di TAT indipendentemente dal volume del sangue. Ciò verifica stabilità del sistema modello e mostra anche la possibilità di utilizzare un endotelio attivato in combinazione con sangue intero. Future su, la camera di cellule endoteliali di sangue può essere usato per studiare il reclutamento di cellule del sangue verso le cellule endoteliali attivate da una varietà di marcatori espressi sulle cellule in varie condizioni e fasi di attivazione. Inoltre, il modello può essere utilizzato in combinazione con agenti farmacologici per valutare gli effetti sulle condizioni infiammatorie. In sintesi, si mostra il grande vantaggio di combinare un modello da camera con cellule del sangue e vascolari umane per creare un essere umano completo sistema in vitro per eseguire importanti indagini di malattia vascolare.

Metodi per l&#39;analisi delle interazioni sangue-vascolare nelle malattie cardiovascolari in genere comportano esperimenti di ricerca degli animali. Risultati creati in modelli animali sperimentali di ricerca possono, tuttavia, hanno poca o nessuna incidenza malattie umane. 1,2 Come tale, c&#39;è una necessità di una buona e affidabile in vitro per studiare le interazioni cellulari tra il compartimento sangue e cellule endoteliali vascolari un sistema simile a quella umana. Abbiamo quindi stabilito un modello di camera di cellule endoteliali del sangue. Questo si basa su un modello descritto precedentemente utilizzato per studiare le interazioni tra biomateriali e sangue umano intero. 3 Contrariamente alle altre configurazioni in vitro in cui il numero di componenti purificati, di solito limitati cioè, trombociti, leucociti e cellule endoteliali sono disponibili, la presente modello incorpora tutti componenti presenti in un vaso sanguigno. La messa a punto del endoteliale sangue cmodello di camera di ell è stato progettato per consentire l&#39;uso di sangue umano appena prelevato con poco o nessun anticoagulante aggiunto. Sangue conservato durante i periodi di tempo più lunghi acquisire nell&#39;ambito cosiddetti lesioni di stoccaggio in cui ripartizione degli eritrociti può interferire con delicate interazioni tra il sangue e le cellule endoteliali. 4 Per evitare la formazione di grumi durante la manipolazione di sangue intero ex vivo richiede elevate dosi di anticoagulanti o che tutto il materiale a contatto con il sangue deve essere non-attivazione. Come superfici non attivanti sono rari in ambiente di laboratorio, i materiali possono in alternativa essere dotati di uno strato protettivo di eparina immobilizzata. Uno strato protettivo di eparina immobilizzata (nel seguito indicato come superficie Corline eparina (CHS)), che può essere applicato alla maggior parte dei materiali che creano una superficie di contatto in cui il sangue può avvenire senza causare l&#39;attivazione della cascata coagulativa. 5 Quindi, fornendo le camere con CHS, il ce endoteliale sanguell modello di camera permette l&#39;uso di concentrazioni molto basse di anticoagulante nel sangue. Evitare l&#39;aggiunta di alte concentrazioni di anticoagulante nel modello endoteliale camera di sangue consente di studiare le interazioni sensibili all&#39;interno di un vaso sanguigno che altrimenti potrebbero essere mascherato. 6 Il modello di camera di cellule endoteliali del sangue è composto da due camere formate allegando cilindri di plastica (altezza: 8 mm; raggio: 9 mm) a un vetrino da microscopio in plastica. I bordi rivolti verso l&#39;alto sui cilindri sono dotati di scanalature che sono dotati di O-ring di gomma utilizzati per sigillare le camere contro la slitta coltura cellulare. Le camere sono solo parzialmente pieni di sangue come l&#39;aria rimasta nella camera mantiene il sangue in movimento quando le camere vengono successivamente ruotati in posizione verticale (Figura 1). Per valutare la funzionalità del modello, abbiamo eseguito esperimenti con entrambi completamente rivestita CHScamera o ombelicale umano Vena cellule endoteliali (HUVEC). Due volumi di sangue separati sono stati analizzati e la formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi (un indicatore indiretto della coagulazione) è stata misurata con enzyme linked test immunoenzimatico (ELISA). Abbiamo poi valutato l&#39;effetto dei volumi di sangue e il fattore di necrosi tumorale (TNF) stimolato le cellule endoteliali su reclutamento dei leucociti mediante analisi di immagine. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Figura 1. Configurazione del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Top disegno schematico della camera di sangue realizzato in PMMA. (B) primarie cellule endoteliali umane sono coltivati ​​su 1-e diapositive da camera. Fresco sangue umano intero è aggiunto due camere su un vetrino da microscopio. Le camere e tutti i materiali utilizzati per la manipolazione del sangue sono trattati con un rivestimento protettivo HS. Dopo aver rimosso le pareti della cell cultura scivolo, le cellule sono posti di fronte al sangue e il sistema è bloccato chiuso. camere cellule (C) La endoteliale sangue vengono poi incubate in rotazione 37 ° C. Successivamente, le reazioni nel comparto sangue possono essere analizzati mediante ELISA e le cellule endoteliali possono essere analizzate mediante microscopia.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

La maggior parte delle malattie conosciute sono accompagnati da disturbi del sistema cardiovascolare. Studi sulla complessità dei percorsi interagenti attivate durante patologie cardiovascolari sono tuttavia limitati dalla mancanza di metodi robusti e fisiologicamente rilevanti. Per modellare eventi vascolari patologici abbiamo sviluppato un saggio in vitro per studiare l&#39;interazione tra endotelio e sangue intero. Il test consiste di cellule endoteliali umane primarie, che sono posti a contatto con il sangue umano intero. Il metodo utilizza sangue nativo con nessuna o pochissima anticoagulante, permettendo studio delle delicate interazioni tra componenti cellulari e molecolari presenti in un vaso sanguigno. Abbiamo studiato la funzionalità del dosaggio confrontando attivazione della coagulazione da diversi volumi di sangue incubate con o senza cellule endoteliali umane della vena ombelicale (HUVEC). Considerando che un volume di sangue più grande contribuito allaun aumento della formazione di trombina antitrombina (TAT) complessi, presenza di HUVEC comportato ridotta attivazione della coagulazione. Inoltre, abbiamo applicato l&#39;analisi delle immagini di attaccamento dei leucociti a HUVEC stimolate con fattore di necrosi tumorale (TNF) e ha trovato la presenza di cellule CD16 + per essere significativamente più alto sul TNF stimolato cellule rispetto alle cellule non stimolate dopo il contatto con il sangue. In conclusione, il dosaggio può essere applicato per studiare le patologie vascolari, dove vengono perturbate interazioni tra l&#39;endotelio e il comparto sangue.

La necessità di CHS rivestimento Per misurare reazioni in sangue intero specifici a quelle sviluppate da cellule endoteliali, tutti i materiali utilizzati per la camera di cellule endoteliali sangue devono essere dotate di un rivestimento CHS prima dell&#39;uso. Figura 2A (sinistra) mostra una camera non rivestito dopo 30 min di contatto del sangue con un coagulo ben visibile presente. Trattare la camera con CHS (Figura 2A, destra) invece protegge il sangue dall&#39;attivazione incontrollata, assicurando che i risultati sono dovuti alle interazioni cellula-sangue endoteliali. L&#39;effetto del volume di sangue alla Camera L&#39;attivazione della coagulazione è più probabile nel sangue stagnante come la probabilità di interazione tra fattori della coagulazione attivati ​​aumenta. Nel modello camera di cellule endoteliali del sangue, il sangue viene tenuto in movimento a causa della circolazione di una bolla d&#39;aria all&#39;interno della camera. In order per determinare l&#39;effetto di variazioni del volume di sangue, e quindi anche dimensioni delle bolle d&#39;aria, una camera CHS rivestito è stato collegato ad un vetrino rivestito CHS che è stato testato con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue intero per 30 min. Il volume di sangue senza alcun movimento dalla bolla d&#39;aria è di 2,5 volte superiore se 1,75 ml di sangue viene aggiunto alla camera rispetto a quando 1,5 ml di sangue viene utilizzato (Figura 2B). I TAT-valori misurati suggerito un aumento TAT-formazione con un aumento del volume del sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) sono state incubate sia con 1,5 o 1,75 ml di sangue intero, nessuna differenza è stata osservata tra i due gruppi, suggerendo che le cellule endoteliali possono modulare l&#39;attivazione della coagulazione (Figura 2D). L&#39;effetto del TNF sulla reclutamento dei globuli e attivazione della coagulazione Al fine di studiare l&#39;effetto di TNF sulla reclutamento dei leucociti, HUVEC erano deliziaed con 20 ng / ml TNF 4 ore prima di contatto con il sangue. Contatto sangue - sia con 1,5 ml o 1,75 ml di sangue - è stato continuato per 30 minuti dopo di che i vetrini di coltura sono state colorate per CD16 (Figura 2F), ripreso e il numero di cellule CD16 + è stato quantificato. Il reclutamento di cellule CD16 + è aumentato in modo significativo con il trattamento con TNF (Figura 2E) 100-256 CD16 + cellule / mm 2 (p &lt;0,0001) con 1,5 ml di sangue e 172-378 (P &lt;0,0001) con 1,75 ml di sangue. La formazione di complessi TAT è stata misurata nei campioni plasmatici corrispondenti del sangue incubati con cellule sia TNFa trattati o non trattati (figura 2G). Cellule TNFa stimolato indotto un raddoppio approssimativo di complessi TAT rispetto alle cellule non trattate. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Ficoure 2: Funzionalità del modello di camera di cellule endoteliali del sangue. (A) Camere con o senza CHS sono stati incubati con sangue intero. Senza CHS, un coagulo si è formato dopo 30 min. Misura della trombina-antitrombina (TAT) complessi, un indicatore indiretto della coagulazione del sangue, in incubate senza CHS era&gt; 6.000 mg / ml. (B) Il volume di sangue non mantenuto in movimento dalla bolla d&#39;aria in rotazione varierà con diversi volumi di sangue. Con l&#39;aggiunta di 1,5 ml di sangue, questo volume sarà 0,3 ml, mentre aumenterà a 0,74 ml con l&#39;aggiunta di 1,75 ml. (C) HUVEC ripreso con microscopia a contrasto di fase mostra tipica morfologia delle cellule endoteliali di un monostrato confluente prima valori TAT per camere completamente CHS rivestiti contatto con il sangue. (D) mostrano una leggera differenza quando vengono aggiunti diversi volumi di sangue. L&#39;aggiunta di 1,5 ml di sangue provocato 35 ± 11 mg / ml (n = 7) in confronto a 1,75 ml, che portano a 8577; 70 mg / ml TAT (n = 8). Questa differenza non è più presente quando HUVEC sono incubati con gli stessi volumi di sangue; 66 ± 55 mcg / ml per 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 mcg / ml per 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificazione del numero di cellule CD16 + presenti su entrambi non stimolato o TNFa stimolato HUVEC dopo contatto con il sangue. Il numero di cellule CD16 + è significativamente aumentata con TNF stimolato cellule incubate sia con 1,5 ml (basale: 100 ± 40 cellule / mm; TNF: 256 ± 121 cellule / mm) o 1,75 ml (basale: 172 ± 67 cellule / mm; TNF: 378 ± 185 cellule / mm) di sangue intero (F) Immagini rappresentative della non stimolato e TNFa stimolato HUVEC colorate per falloidina (rosso), CD16 (verde) e DAPI (blu).. Barra di scala = 250 micron (G) La formazione di complessi TAT è approssimativamente raddoppiata TNFa stimolato cellule rispetto alle cellule non trattate incubate con il sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 volte più TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 volte più TAT, n = 4). Tutti i valori sono presentati come media ± deviazione standard; valori di p sono stati calcolati mediante test t spaiati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per lo studio delle interazioni tra l&#39;uomo di sangue intero e l&#39;endotelio

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.4K Views.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

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Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Ricerca

Bioingegneria

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Immunologia e infezioni

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Differenziazione e stimolazione meccanica di cellule endoteliali derivate da hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autore in primo piano: Studio di cellule endoteliali derivate da hiPSC coltivate sotto stimolazione meccanica mediata da fluidi 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Biologia dello sviluppo

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Modelli arteriosi in vitro coltivati in cellule 3D per lo studio del targeting vascolare del farmaco sotto flusso

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Valutazione delle proprietà anticoagulanti e anti-infiammatori delle cellule endoteliali mediante coltura cellulare 3D e Non intero anticoagulato

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Medicina

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

A Novel

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

In vitro e in vivo modello per studiare l'adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

Modelli arteriosi in vitro coltivati in cellule 3D per lo studio del targeting vascolare del farmaco sotto flusso

Valutazione delle proprietà anticoagulanti e anti-infiammatori delle cellule endoteliali mediante coltura cellulare 3D e Non intero anticoagulato

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale