Le tecniche che monitorano il carico batterico e un neutrofilo rispondono contemporaneamente possono fornire informazioni sui meccanismi di persistenza dello Staph aureus e sull'efficacia delle strategie di trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che più parametri possono essere misurati longitudinalmente in un ospite vivo per tutta la durata dell'infezione. È fondamentale mostrare dove posizionare la ferita su un dorsum di topo, come asportare la pelle e come inoculare la ferita con Staph aureus.
Inizia scongelando il ceppo di aureo Staph di bioluminescenza di interesse dallo stoccaggio negativo di 80 gradi Celsius sul ghiaccio. Prima di strisciare la coltura su una piastra di agar di sangue bovino al 5%. Per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.
La mattina seguente, trasferire da tre a quattro colonie individuali dalla piastra di Staph aureus nel brodo di soia triptico, o TSB. Integrato con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo per un'incubazione di scuotimento durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, diluire 120 microlitri di campione di coltura in sei millilitri di TSB.
Con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo, per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto. Quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 0,5, trasferire tre millilitri di sospensione batterica in 10 millilitri ghiacciati DPBS. Dopo aver decantato attentamente il supernatante, aggiungere ulteriori DPBS refrigerati al pellet e vortice accuratamente i batteri ri-sospesi.
Dopo una seconda centrifugazione, sospendere di nuovo il pellet batterico in 1,5 millilitri di PBS sul ghiaccio. Per verificare la concentrazione di batteri, diluire in serie 100 microlitri della sospensione batterica di un fattore da 1 x 10 al 4° e 1 x 10 al 5°, in PBS fresco. E piastra 20 microlitri di ogni diluizione su singole piastre di agar.
Dopo un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, conta il numero di unità che formano colonie per esame lordo per calcolare la concentrazione batterica del giorno precedente. Per il mento della pelle escisionale degli animali riceventi, confermare una mancanza di risposta al dito del dito, prima di radere una sezione di uno per due pollici sul retro del mouse. Pulire delicatamente per rimuovere eventuali peli randagi.
E disinfettare la pelle esposta, con iodio sequenziale al 10% di povidone e applicazioni di garza imbevuta di etanolo al 70%. Spostandosi verso l'esterno dal centro dell'area chirurgica, in un modello a spirale. Dopo aver permesso alla pelle di asciugarsi per circa un minuto, premere saldamente una biopsia sterile a pugno di sei millimetri al centro dell'area chirurgica preparata.
Ruotare la biopsia del punzone per creare un contorno circolare sulla pelle, che taglia completamente il tessuto cutaneo e almeno una sezione del contorno. Fare attenzione a non tagliare nella fascia o nel tessuto sottostante. Quindi utilizzare forbici sterili e forcep, per tagliare l'epidermide e il derma, seguendo il modello circolare impresso dalla biopsia del punzone.
Per l'inoculazione di Staph aureus, riempire una siringa per insulina calibro 28 con 50 microlitri dell'inoculante batterico bioluminescente preparato. E usa un dito per tirare di lato il derma dell'animale ferito. Tenendo la siringa quasi parallela al tessuto, inserire lentamente la siringa nel tessuto fino a quando non si sente un'improvvisa diminuzione della resistenza.
Indicando il piercing della fascia. Con l'ago posto al centro della ferita, consegnare lentamente l'intero volume dell'inoculante. Verificare che l'inoculante formi una bolla al centro della ferita, con perdite o dispersione minime.
E rimuovere lentamente la siringa dall'animale. Quindi riportare l'animale nella sua gabbia con calore e monitoraggio fino al pieno recupero. Dopo il mento e l'infezione, e ogni giorno durante l'esperimento, posizionare il topo anestetizzato in un imager bioluminescente e florescence, con la ferita il più piatta possibile.
Nel software imager, selezionare la luminescenza e fotografare come modalità di imaging. Il tempo di esposizione deve essere preimpostato a un minuto con un piccolo binning, F/Stop 1 per la luminescenza, F/Stop 8 per la fotografia e aperto per il filtro di emissione. Quindi fare clic su acquisisci, per registrare l'immagine.
Per l'imaging a fluorescenza in vivo, selezionare la fluorescenza e fotografare, come modalità di imaging. Il tempo di esposizione deve essere preimpostato a un secondo a piccolo binning, F/Stop 1 per la fluorescenza, F/Stop 8 per la fotografia e lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 465 su 30 nanometri e 520 su 20 nanometri, con un'alta intensità della lampada, rispettivamente. Quindi fare clic su acquisisci per registrare l'immagine.
Dopo aver ottenuto entrambi i set di immagini, riportare l'animale nella sua gabbia, con monitoraggio, fino al completo recupero. Per l'analisi delle immagini, apri l'immagine da quantificare, in un programma software di analisi delle immagini appropriato, e posiziona l'area circolare di interesse predefinita sull'intera area della ferita, inclusa la pelle circostante. Fare clic sulla regione di misura di interesse e registrare i valori per il flusso medio per la ferita, per consentire di tracciare il flusso medio di ogni segnale rispetto al tempo.
Per misurare la guarigione della ferita, montare una regione circolare di interesse sul bordo della ferita e misurare l'area della ferita in centimetri al quadrato, per consentire la trama del cambiamento frazionato dalla linea di base rispetto al tempo. In questo esperimento rappresentativo, l'espressione condizionale EGFP myeloid differentiation primary response 88, Or MyD88 knockout mice, ha dimostrato una maggiore suscettibilità all'inoculazione di Staph aureus, rispetto all'EGFP non condizionale che esprimeva animali. Con una letalità dell'80% osservata durante i primi otto giorni di infezione.
Entrambi i ceppi di topi hanno perso circa il 5% del loro peso corporeo immediatamente dopo l'infezione. Tuttavia, l'EGFP condizionale che esprimeva topi recuperava i loro pesi originali entro il secondo giorno. Mentre i topi MyD88 no.
La chiusura delle ferite in presenza di infezione da Staph aureus non era diversa tra i due ceppi. Tuttavia, i topi knockout MyD88 feriti sterilemente, avevano un difetto significativo nella guarigione delle ferite, rispetto all'EGFP condizionale che esprimeva animali. L'imaging di animali interi ha rivelato un maggiore carico batterico, come evidenziato da un aumento del segnale bioluminescente nelle ferite degli animali knockout MyD88, rispetto all'EGFP condizionale che esprime animali.
È stata osservata anche una diminuzione del 40% del traffico iniziale di neutrofili verso ferite non infette di animali knockout MyD88 rispetto all'EGFP condizionale che esprime animali. Quando 1 x 10 alla 7a colonia che forma unità di Staph aureus sono state introdotte immediatamente dopo il mento, il traffico di neutrofili è stato significativamente attenuato negli animali knockout rispetto all'EGFP condizionale che esprime animali. Prima di erogare i batteri, assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella siringa e che la posizione dell'ago sia posizionata correttamente al centro della ferita.
I tessuti animali possono essere raccolti al punto finale per misurare l'espressione di proteine di interesse e diffusione batterica dalla ferita. Lo Staph aureus è contagioso per l'uomo. Pertanto, i dispositivi di protezione individuale devono essere indossati durante la manipolazione dei batteri e si deve prestare attenzione quando si maneggia una siringa contenente l'agente patogeno.
Questa tecnica ha aiutato a esplorare l'uso di trattamenti biologici per le infezioni da Staph aureus che migliorano la risposta immunitaria innata degli ospiti contro le infezioni.
