Capire come gli astrociti si sviluppano e stabiliscono la loro complessa morfologia è essenziale per capire come il cervello si sviluppa e funziona. Questo protocollo descrive come analizzare gli aspetti chiave della morfologia degli astrociti nel tessuto cerebrale. Questo protocollo utilizza un codice personalizzato per misurare il volume del territorio degli astrociti in sezioni di tessuto spesso.
Questa strategia può anche essere applicata per misurare la quantità di sovrapposizione di territorio tra astrociti vicini. Combinando questo protocollo con la manipolazione genetica degli astrociti, i ricercatori possono studiare direttamente il ruolo di proteine e percorsi specifici nello sviluppo degli astrociti e nell'interazione astrocita-astrocita Per iniziare, preparare una nuova soluzione di TBST aggiungendo 1 millilitro di 10% Triton X a un tubo da 50 millilitri e riempiendo il tubo a 50 millilitri con TBS. Preparare 2 millilitri di soluzioni bloccanti e anticorpali per ciascun cervello combinando siero di capra e TBST in un Tubo da 15 millilitri.
Quindi, etichettare una piastra a 24 pozzetti per posizionare campioni diversi in righe diverse in soluzioni diverse in colonne diverse, quindi aggiungere un millilitro di TBST alle prime tre colonne etichettate come lavare 1, lavare 2 e lavare 3 e aggiungere 1 millilitro di soluzione bloccante alla quarta colonna. Preparare un plettro di vetro sciogliendo l'estremità di una pipetta Pasteur da 5,75 pollici in un piccolo gancio usando un bruciatore Bunsen, quindi trasferire le sezioni di tessuto dalla piastra a 12 pozzetti nella colonna di lavaggio 1 della piastra a 24 pozzetti usando il plettro, quindi lavare le sezioni per 10 minuti ciascuna nel lavaggio 1, 2, e 3 pozzetti utilizzando il plettro di vetro per trasferire le sezioni da un pozzetto all'altro, seguito dall'incubazione delle sezioni per un'ora nella soluzione di blocco. Preparare q millilitro di soluzione anticorpale primaria aggiungendo l'anticorpo alla soluzione anticorpale, quindi vortice brevemente e centrifuga per 5 minuti a maggiore o uguale a 4.000 volte g a 4 gradi Celsius.
Quindi, incubare le sezioni nell'anticorpo primario per 2 o 3 notti a 4 gradi Celsius durante l'agitazione. Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, aspirare il TBST day-1 dai pozzetti di lavaggio, quindi aggiungere 1 millilitro di nuovo TBST a ciascun pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzetto di lavaggio. Quindi, incubare sezioni in anticorpi secondari per 3 ore a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione degli anticorpi secondari, aspirare il TBST del giorno 2 dai pozzetti di lavaggio, quindi aggiungere 1 millilitro di nuovo TBST a ciascun pozzetto di lavaggio e spostare le sezioni nel primo pozzo di lavaggio. Durante il lavaggio finale, estrarre il supporto di montaggio da 4 gradi Celsius e lasciarlo riscaldare a temperatura ambiente, quindi preparare una miscela 2 a 1 di TBS e acqua deionizzata e aggiungerlo a una capsula di Petri. Quindi, preparare un vetrino per microscopio aggiungendo 800 microlitri di miscela 2 a 1 di TBS e acqua deionizzata alla superficie.
Trasferire bene le sezioni dal lavaggio 3 alla piastra di Petri, quindi utilizzando un pennello fine, trasferire le sezioni una alla volta dalla piastra di Petri nel liquido sulla diapositiva. Quindi, disporre con cura le sezioni in modo che siano piatte sulla diapositiva usando il pennello. Con attenzione, rimuovere il liquido in eccesso dal vetrino con una pipetta P-1000, seguita dall'aspirazione sottovuoto.
Una volta rimosso tutto il liquido in eccesso dalla slitta, utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere immediatamente 1 goccia di supporto di montaggio a ciascuna sezione e posare delicatamente un coperchio sulla slitta. Lasciare che il supporto di montaggio si diffonda per alcuni minuti e quindi rimuovere qualsiasi supporto di montaggio in eccesso che esce da sotto il coperchio scivolando mediante aspirazione sottovuoto. Successivamente, sigillare tutti e quattro i bordi del coperchio con smalto trasparente.
Lasciare asciugare le diapositive per 30 minuti a temperatura ambiente e poi conservarle piatte a 4 gradi Celsius. Utilizzando un obiettivo 10x, individuare le singole cellule per l'imaging e annotare la specifica regione o sottoregione del cervello rilevante per l'esperimento, quindi utilizzando la manopola di messa a fuoco, determinare se l'intero astrocita è contenuto all'interno della sezione. Successivamente, passa a un obiettivo ad olio di ingrandimento più elevato e metti a fuoco la cella.
Mentre guardi attraverso l'oculare, usa la manopola di messa a fuoco per spostarti dall'alto verso il basso della cellula, quindi ispeziona visivamente la cellula per assicurarti che l'intera cellula sia contenuta all'interno della sezione. Utilizzando il software di acquisizione associato ai microscopi confocali, regolare i parametri di acquisizione per ottenere un rapporto segnale-rumore appropriato e un livello di dettaglio, quindi utilizzare lo zoom 2x per un obiettivo 40x e senza zoom se si utilizza un obiettivo 60x o 63x. Imposta i limiti superiore e inferiore dello Z-stack con una dimensione del passo di 0,5 micrometri assicurando che l'intero astrocita venga catturato con la prima e l'ultima immagine senza alcuna etichettatura fluorescente della cellula.
Prima di iniziare l'analisi, installare il file di estensione dello scafo convesso, XtspotsConvexHull, incollando il file nella sottocartella rtmatlab della cartella XT. Utilizzando Imaris File Converter, convertire le immagini in formato IMS. Quindi, aprire un file di immagine nel software di analisi delle immagini e selezionare il pulsante Vista 3D per visualizzare l'immagine in modalità 3D, assicurandosi che la cella soddisfi i criteri di inclusione.
Per creare una superficie, fate clic sull'icona blu Aggiungi nuove superfici, quindi create una regione di interesse attorno alla cella immettendo le quote nelle caselle sotto le dimensioni dello strumento di creazione della superficie o trascinando i bordi della casella gialla. Quindi, regolate l'intensità assoluta della soglia trascinando la barra gialla o inserendo i valori nella casella in modo che la superficie grigia riempia il più possibile il segnale della cella senza andare oltre il limite della cella. Successivamente, fate clic sulla freccia verde per completare la generazione della superficie.
Esaminate attentamente la superficie appena generata ed eliminate tutti i pezzi di superficie che non fanno parte della cella selezionandoli, quindi facendo clic sullo strumento Modifica matita seguito dall'opzione Elimina. Per unificare i pezzi di superficie rimanenti, fare clic sull'icona Filtro imbuto per selezionare tutto, quindi fare clic sull'icona Modifica matita e selezionare l'opzione Unifica. Fare clic sull'icona arancione Aggiungi nuovi punti e selezionare il canale sorgente corretto dall'elenco a discesa, quindi immettere un valore di diametro XY stimato di 0,400 micrometri nella casella.
Quindi, fai clic sulla freccia verde per completare la creazione dei punti, quindi riseleziona i punti. Fate clic sull'icona Filtro (Filter) e selezionate Distanza più breve dalle superfici Superfici superfici X, dove Superfici X è la superficie analizzata dall'elenco a discesa, assicurando che i pulsanti di alimentazione soglia inferiore e soglia superiore siano verdi. Quindi, inserisci una distanza minima di meno 1,0 micrometri nella casella di soglia inferiore e una distanza massima di 0,1 micrometri nella casella di soglia superiore, quindi fai clic sul pulsante Duplica sezione in nuovi punti, assicurandoti che i punti appena creati siano selezionati nel pannello in alto a sinistra della finestra del software.
Successivamente, fai clic sull'icona Strumenti ingranaggi, quindi fai clic sul plug-in Convex Hull solo una volta e attendi che venga visualizzata la finestra MATLAB e poi scompaia con conseguente scafo solido nella vista 3D. Nel pannello in alto a sinistra, assicurati che sia selezionato Scafo convesso di Spots X Selection, Shortest Distance where Spots X Selection is the Newly Created Spots e quindi fai clic sullo scafo per selezionarlo. Quindi, fai clic sull'icona Statistiche grafico.
Nella scheda Selezione, assicurarsi che Valori specifici sia selezionato dall'elenco a discesa superiore, quindi scegliere Volume dall'elenco a discesa in basso, quindi registrare il volume dello scafo e salvare il file, passando all'immagine successiva. Il volume del territorio degli astrociti è stato misurato negli astrociti che esprimono una proteina fluorescente rossa mirata alla membrana. L'abbattimento della molecola di adesione cellulare arricchita di astrociti, hepaCAM, riduce significativamente il volume del territorio degli astrociti.
L'analisi a mosaico con doppi marcatori è stata utilizzata per generare topi in cui gli astrociti selvatici esprimono una proteina fluorescente rossa e gli astrociti knockout hepaCam esprimono una proteina fluorescente verde. È stata calcolata la percentuale di sovrapposizione di territorio tra coppie di astrociti proteici fluorescenti rossi e verdi vicine. I topi con modificazione genetica di hepaCAM e astrociti verdi hanno mostrato una percentuale significativamente aumentata di sovrapposizione del territorio con i loro vicini di tipo selvatico rosso rispetto alle coppie di astrociti wild-type-only.
Questo risultato dimostra che hepaCAM è necessario per il normale volume del territorio astrocitario e la piastrellatura degli astrociti. È fondamentale garantire che la cellula soddisfi i criteri di inclusione. Una cella incompleta avrà un volume di territorio inferiore e potrebbe influire sui risultati e sulle conclusioni complessive.
