Questo lavoro è stato finanziato con il sostegno attraverso la Fondazione McNair, NARSAD e NINDS concedere R00NS064171-03.

1. Nella fissazione del cervello in situ * Preparare una siringa da 10 ml (28 gauge) riempite con tampone fosfato (PBS). * Preparare una siringa da 10 ml (28 gauge), riempito con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Riservare un ulteriore 5-10 ml di PFA / PBS per il fissaggio post. <ol><li> Iniettare intraperitoneale sperimentale del mouse con una dose letale di Avertin o Nembutal. </li><li> Una volta che il mouse è sedato, bagnato l&#39;addome con l&#39;etanolo e sicuro il mouse fino al fondo di un vassoio a strati con sughero, cera, o elastomero di silicone con perni di dissezione. Con addome rivolto verso l&#39;alto, sicuro il quattro zampe alla superficie - la diffusione di loro il più ampio possibile. </li><li> Afferra la pelle con una pinza a livello dello sterno, e tagliato trasversalmente per esporre il fegato. Taglio lateralmente e poi attraverso le costole e il diaframma. Rimuovere il lembo costola e continuare a tagliare fino a quando il cuore è accessibile. </li><li> Forare o tagliare l&#39;atrio destro di drenare il sangue in circolazione. </li><li> Filo di sangue residuo sistema circolatorio per perfusione di PBS attraverso ventricolo sinistro. </li><li> Accesso al foro stesso ago, fissare tutto con il mouse perfusione successive di PBS / PFA attraverso ventricolo sinistro. </li></ol> 2. Dissezione e l&#39;estrazione del cervello <ol><li> Togliere la pelle dalla testa, del collo e cranio, tagliando intorno canale uditivo e le orbite degli occhi, seguito da tirando la pelle anteriormente per esporre il cranio. * Vedere la Figura 2 per una illustrazione delle fasi 2.2) a 2.5) </li><li> Utilizzando un paio di forbici osso, tagliato trasversalmente dall&#39;occhio presa attraverso il turbinati nasali. Fate questo per ogni lato. Il taglio trasversale dovrebbe essere anteriore agli occhi e bulbi olfattivi. </li><li> Tagliati longitudinalmente da ogni canale uditivo cavità oculare. </li><li> Utilizzando un paio di forbici dissezione piccolo, tagliare la piastra occipitale osso sovrastante il cervelletto da un canale orecchio all&#39;altro. </li><li> Con le forbici dissezione stessa, tagliare anteriormente lungo la linea mediana al livello dei bulbi olfattivi. </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere ogni piatto osso dal cervello, avendo cura di rimuovere qualsiasi tessuto connettivo in modo che il cervello rimane intatto quando si solleva l&#39;osso. </li><li> Snip nervi ottici e del cranio, tagliare la parte superiore vertebre cervicali, e rimuovere il cervello in fissativo. </li><li> Post-fix per 1-2 ore a 4 ° C. Lavare 3 volte 15 minuti ciascuno in PBS. </li></ol> 3. Agarosio embedding <ol><li> Fate sciogliere il 2% ad alta resistenza, basso punto di gel di agarosio di tipo IB (numero di catalogo Sigma: A0576) in PBS salina con forno a microonde. </li><li> Trasferimento agarosio fuso in una provetta. Luogo provetta in un bagno caldo incubatore o acqua (40 ° -41 ° C) fino al raggiungimento dell&#39;equilibrio di temperatura. </li><li> Colla tessuto cerebrale fissata su lo stantuffo della siringa campione con colla cianoacrilato (Figura 3A). Pennello un sottile strato di satura di saccarosio-PBS soluzione sulla superficie del tessuto cerebrale per facilitare il successivo rilascio del ring agarosio dalle sezioni di cervello. </li><li> Disegna lo stantuffo con tessuto cerebrale nella sede pistone (Figura 3B). </li><li> Pipetta o versare calde agarosio nella sede stantuffo, che copre il tessuto cerebrale. Evitare di inglobare bolle d&#39;aria nel agarosio. Le bolle d&#39;aria nel agarosio comprometterà la qualità fetta. </li><li> Bloccare il campione con una siringa freddo (0 ° a -25 ° C) blocco agghiacciante per 1 minuto per impostare l&#39;agarosio (Figura 3C). </li></ol> 4. Sezionamento fetta cervello con la Compresstome <ol><li> Assemblare la siringa contenente il campione di tessuto cerebrale in Compresstome (Fig. 3D). </li><li> Allineare il bordo della lama di un rasoio a stretto contatto con la presa della siringa campione (Fig. 3E). </li><li> Riempire il serbatoio con la soluzione tampone PBS. </li><li> Ruotate di uno spessore della fetta micrometro avanti per estrudere l&#39;agarosio-cervello blocco di tessuto dalla siringa campione. </li><li> Premere il pulsante &quot;start&quot; sulla centralina del Compresstome di avviare il processo di sezionamento. </li><li> Ripetere i passaggi 4.4) a 4,5) fino a fettine desiderati sono ottenuti a determinare lo spessore. </li><li> Cervello fette raccolto con pennello o una pipetta di fiale o pozzi colorazione piena di PBS (Figura 3F). </li></ol> 5. Cancellazione ottico <ol><li> Preparare un 75% vol: vol soluzione di glicerolo: PBS. </li><li> Versare (o pipetta) via la metà del volume di PBS di lavaggio dai fettine di cervello raccolti. </li><li> Aggiungere nuovamente il volume rimosso con glicerolo / PBS. </li><li> Lasciare equilibrare con miscelazione delicata a 4 ° C fino a quando il lavandino fette. </li><li> Ripetere i passaggi 6.2) a 6.4) fino a una concentrazione di glicerolo finale raggiunge il 75%. </li><li> Sostituire la soluzione con il 90% glicerolo in PBS e lasciare equilibrare. * Nota: fare attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria mentre l&#39;aggiunta di soluzioni di glicerolo. Versare soluzioni lentamente e mescolare delicatamente, dal momento che bolle d&#39;aria interferisce con uniforme Equilibrazione e saranno riportati a scivolare di montaggio. </li></ol> 6. Fetta di montaggio per l&#39;imaging <ol><li> Taglio biadesivo sigillo (SA-S-1L, Grace Bio-Labs) in un rettangolo aperto per soddisfare l&#39;area visibile di una diapositiva micro (Superfrost Plus, 25 X 75 X 1 mm, cat. # 48311-703, VWR ) con lati di 2-3 mm di larghezza. </li><li> Luogo fettine di cervello all&#39;interno del centro del rettangolo di nastro adesivo con una pipetta o pennello. Rimuovere l&#39;eccesso di glicerolo con aspirazione delicata. </li><li> Disporre le fette del cervello su diapositive, in sequenza desiderata con un pennello. </li><li> Vetro di copertura Abbassare delicatamente (24 X 60 mm, cat. # 48383-139, VWR) sul nastro adesivo, facendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria. Esercitare una leggera pressione sul vetro di copertura per assicurare un contatto con del nastro adesivo. </li><li> Aspirare il glicerolo in eccesso dai bordi tra diapositive e coprioggetti. </li><li> Sigillo di diapositive e coprioggetto utilizzando smalto trasparente per unghie. </li><li> Lasciare asciugare prima di imaging, o conservare a lungo termine in scatole di diapositive a 4 ° C. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: L&#39;elaborazione, l&#39;imaging, e analizzando il tessuto cerebrale fluorescente sono diventate indispensabili per lo studio della neurobiologia. Molte di queste indagini richiedono sofisticate manipolazioni genetiche per ottenere l&#39;espressione giornalista in sottoinsiemi mirati neuronale, seguita da entrambe le analisi di immagini a bassa e ad alta risoluzione. Spesso limitazioni sperimentali e tecniche rendono impossibile ottenere questi tipi di dati dello stesso animale, o in maniera rapida. Preparazione di ottica-ripulito, semi-densi sezioni di cervello per l&#39;imaging fluorescente aiuti in questa sfida. Un esempio di una fetta intatta del cervello di spessore etichettato con un virus geneticamente modificato per esprimere rabbia progettato EGFP, e ripreso usando la microscopia confocale e epifluorescente è mostrata in Figura 4 e Figura 5, rispettivamente. Per l&#39;imaging epifluorescente abbiamo usato una Leica M205 FA, e per l&#39;acquisizione di immagini confocale abbiamo usato un Zeiss LSM 510. A causa della relativa semplicità del protocollo allegato, questo metodo è in grado di produrre dati di immagini utili da esprimere reporters tessuto fluorescente con un tempo di risposta di meno di un giorno, ed è compatibile sia con microscopia ottica a bassa e ad alta risoluzione. Se il ricercatore sceglie di incorporare ulteriori modalità di etichettatura post-mortem, immunoistochimica, o fare sezioni più sottili, il protocollo si allunga di conseguenza. Tuttavia, il metodo di cui sopra rappresenta un metodo semplice e relativamente high-throughput per lo screening modelli di espressione giornalista vitale nel cervello intatto. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Diagramma di flusso diagraming la fissazione, dissezione, affettare, radura, e la procedura di montaggio semi-densi fettine di cervello. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Schema di passi sequenziali taglio per estrarre il cervello intatto mouse. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Passaggi per montare e tagliare tessuti cerebrali usando la Compresstome. A) Posizionamento del tessuto cerebrale sul pistone di taglio con supercolla. B) Disegno del tessuto cerebrale montato nel pistone per l&#39;incorporamento agarosio. C) Consolidare una spina del cervello agarosio utilizzando un blocco raffreddato compressione. D) Inserimento di plug cervello agarosio e stantuffo in camera di taglio Compresstome. E) L&#39;allineamento di lametta al dispositivo stantuffo. F) Taglio e raccolta di fette di cervello in camera di buffer di Compresstome. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Immagini di microscopia luce di una spessa fetta di glicerolo-ripulito tessuto cerebrale attraverso la corteccia frontale che esprime maggiore proteina fluorescente verde (EGFP). A) fetta coronale attraverso un cervello di topo (200 um di spessore) etichettato con un vettore virale EGFP esprimere e ripreso a bassa risoluzione con un stereoscopio epifluorescente. Scala grafica, 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/2807/2807fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Immagine Alto ingrandimento fluorescente strato di 5 / 6 neuroni corticali in una fetta spessa cancellata cervello. A) immagine confocale ad alta risoluzione di una proiezione massima Z-stack (150 um di spessore) attraverso la regione evidenziata in (Figura 4). Scala grafica, 25 um.

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	<li>Pfister, H., Lichtman, J., Reid, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Connectome Project. , (2009).</li><li>Briggman, K. L., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+neural+circuit+reconstruction+with+volume+electron+microscopy+techniques.">Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques.</a> Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Arenkiel, B. R., Ehlers, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy.">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altering+the+genome+by+homologous+recombination.">Altering the genome by homologous recombination.</a> Science. 244, 1288-1292 (1989).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification,+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification, and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J. Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Gene fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li></ol>

Jian-Qiang Kong è un dipendente di Precisionary Instruments, Inc., che produce un prodotto utilizzato in questo articolo.

Dato l&#39;applicazione diffusa di utilizzare proteine ​​fluorescenti a bersaglio sottoinsiemi neuronale per le indagini tramite microscopia ottica, la necessità di rapido dello schermo, l&#39;immagine, e analizzare le reti neurali all&#39;interno del tessuto cerebrale intatto è diventata insostituibile. I progressi tecnici nello sviluppo di vettori virali user-friendly, nelle tecniche di elettroporazione in vivo, e ceppi di topi geneticamente modificati, off...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<th&gt; Nome della voce</th&gt;<th&gt; Azienda</th&gt;<th&gt; Numero di catalogo</th&gt;<th&gt; Commenti (opzionale)</th&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Osso forbici</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 16044-10</td&gt;<td&gt;-O equivalente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dissezione forbici</td&gt;<td&gt; FST</td&gt;<td&gt; 14084-08</td&gt;<td&gt;-O equivalente</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tipo IB agarosio</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A0576</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Compresstome</td&gt;<td&gt; Strumenti Precisionary</td&gt;<td&gt; VF-200</td&gt;<td&gt;-Altri vibratomes sono compatibili</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biadesivo</td&gt;<td&gt; Grace Bio-Labs</td&gt;<td&gt; SA-S-1L</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Superfrost Inoltre diapositive</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48311-703</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Copertura in vetro</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48383-139</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glicerolo</td&gt;<td&gt; EMD Chemicals Inc.</td&gt;<td&gt; GX0185-6</td&gt;<td&gt;-O equivalente</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

a rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices

Un obiettivo fondamentale sia di base e clinica delle neuroscienze è quello di comprendere meglio le identità, trucco molecolare, e modelli di connettività che sono caratteristici di neuroni nel cervello sia normale e malato. In questo senso, un grande sforzo è stato posto sulla costruzione di mappe ad alta risoluzione neuroanatomici 1-3. Con l&#39;espansione della genetica molecolare e progressi nella microscopia luce è venuta la possibilità di interrogare non solo morfologie neuronale, ma anche la composizione molecolare e cellulare dei singoli neuroni e delle loro reti associate 4. Importanti progressi nella capacità di segnare e manipolare i neuroni attraverso le tecnologie transgeniche e gene targeting nei roditori ora consentire agli investigatori di sottoinsiemi neuronale &#39;programma&#39; a volontà 5-6. Probabilmente, uno dei contributi più influenti di neuroscienza contemporanea è stata la scoperta e la clonazione di geni che codificano per proteine ​​fluorescenti (PQ) in invertebrati marini 7-8, accanto ai loro ingegneria successive per produrre una sempre maggiore cassetta degli attrezzi di giornalisti vitale 9. Sfruttando cellula tipo-specifici promotore di attività mirate a guidare l&#39;espressione FP in discrete popolazioni neuronali offre ora indagine neuroanatomici con precisione genetica. Ingegneria espressione FP nei neuroni ha migliorato notevolmente la nostra comprensione della struttura del cervello e funzione. Tuttavia, i singoli neuroni imaging e le loro reti associate nei tessuti cerebrali profondi, o in tre dimensioni, è rimasta una sfida. A causa di alto contenuto di lipidi, tessuto nervoso è piuttosto opaco e auto presenta fluorescenza. Queste proprietà intrinseche biofisiche rendono difficile la visualizzazione e l&#39;immagine neuroni fluorescente ad alta risoluzione con un microscopio confocale epifluorescente o al di là profondità di decine di micron. Per aggirare questo problema i ricercatori spesso utilizzano seriale sottile sezione imaging e metodi di ricostruzione 10, o 2-fotone microscopia a scansione laser 11. Svantaggi attuali a questi approcci sono associati alta intensità di lavoro di preparazione dei tessuti, o troppo costose strumentazioni rispettivamente. Qui, vi presentiamo un metodo relativamente rapido e semplice per visualizzare le cellule fluorescente a fette topo fisso semi-densi cervello deselezionando ottici e di imaging. Nel protocollo allegato si descrivono i metodi di: 1) tessuto cerebrale di fissaggio in situ tramite perfusione intracardial, 2) la dissezione e la rimozione di intero cervello, 3) incorporando cervello stazionario in agarosio, 4) di precisione semi-densi preparazione fetta utilizzando nuovi strumenti vibratome compensazione, 5) il tessuto cerebrale da un gradiente di glicerolo, e 6) il montaggio su vetrini per microscopia ottica e z-stack ricostruzione (Figura 1). Per la preparazione di fettine di cervello abbiamo implementato un pezzo relativamente nuovo di strumenti chiamato &#39;Compresstome&#39; VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Questo strumento è un semi-automatico microtomo dotato di un anticipo motorizzato e vibrazioni sistema blade con caratteristiche simili in funzione di vibratomes altri. A differenza di altri vibratomes, il tessuto da tagliare è montato in una spina agarosio all&#39;interno di un cilindro di acciaio inox. Il tessuto viene estruso a spessori desiderati dal cilindro, e tagliare con la lama in avanti avanzando vibrante. La spina agarosio / sistema cilindro permette di tessuto riproducibile montaggio, allineamento e il taglio di precisione. Nelle nostre mani, il &#39;Compresstome&#39; alte rese fette qualità dei tessuti per elettrofisiologia, immunoistochimica, e diretto fissa tessuto di montaggio e di imaging. In combinazione con compensazione ottica, qui abbiamo dimostrato la preparazione di semi-densi fettine di cervello fissata per imaging ad alta risoluzione fluorescenti.

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A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all&#39;interno intatto tessuto nervoso.

Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

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16.2K Views.  Baylor College of Medicine (BCM). Qui si descrive un metodo rapido e semplice per celle di immagine fluorescente in semi-densi fettine di cervello. Fissando, affettare, e otticamente compensazione tessuto cerebrale si descrivono le modalità standard di imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le singole cellule e reti neuronali all'interno intatto tessuto nervoso.

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An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

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Neuroscienze

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Ad alta risoluzione magnetica funzionale per immagini Metodi risonanza per mesencefalo umano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Alta risoluzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Manuale Protocollo Segmentazione for Human ippocampale Sottocampi Utilizzando 3T Risonanza Magnetica

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Ad alta risoluzione strutturale Risonanza Magnetica del subcortex Umana<I&gt; In Vivo</I&gt; E Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

Alta risoluzione Volume Imaging di neuroni nell'esclusione di uso di fluorescenza metodo e dedicato dispositivi microfluidici

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Un approccio alternativo per studiare eventi primari nella neurodegenerazione utilizzando fettine di cervello di ratto Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...