Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 e da T32 Training Grant 5T32GM081740

Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud.
1. Preparazione della soluzione stock
<ol><li>Soluzione 1 (1 L): A 900 mL di H2O deionizzato aggiungere 100 mL di 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mL di Triton X-100.</li>
	<li>Soluzione 2 (1 L): a 900 mL di H2O deionizzato, aggiungere 100 mL di PBS 10x, 2mL di Tween-20 e 1 mL di soluzione stock di eparina da 10 mg/mL.</li>
	<li>Soluzione 3 (500 mL): a 400 mL di Soluzione 1, aggiungere 11,5 g di glicina e 100 mL di dimetilsolfossido (DMSO).</li>
	<li>Soluzione 4 (50 mL): a 42 mL di Soluzione 1, aggiungere 3 mL di siero corrispondente e 5 mL di DMSO.</li>
	<li>Soluzione anticorpale primaria (50 mL): a 46 mL di Soluzione 2, aggiungere 2,5 mL di DMSO e 1,5 mL di siero corrispondente.</li>
	<li>Soluzione anticorpale secondaria (50 mL): a 48,5 mL di Soluzione 2, aggiungere 1,5 mL di siero corrispondente. NOTA: per la soluzione 4, la soluzione primaria e la soluzione secondaria, utilizzare un siero corrispondente all'anticorpo secondario (ad es. capra, cavallo, bovino).</li>
</ol>2. Preparazione del campione
NOTA: eseguire i passaggi da 2.1 a 2.7 in una cappa aspirante per limitare l'esposizione al PFA.
<ol><li>Anestetizzare profondamente il giovane ratto (3-6 settimane) usando il sevoflurano; procedere a 2.2 quando il ratto non risponde e non risponde al pizzico della dita e della coda.</li>
	<li>Posare il ratto in posizione supina e fare un'incisione attraverso la parete addominale usando un paio di forbici dell'iride.</li>
	<li>Tagliare attraverso il fondo della gabbia toracica fino alla clavicola su entrambi i lati della gabbia toracica usando le forbici Mayo.</li>
	<li>Apporre lo sterno e le costole lontano dal cuore e dai polmoni con un mostato.</li>
	<li>Forare il ventricolo sinistro con un ago da 23 G attaccato a una pompa di perfusione e tagliare l'atrio destro con le forbici dell'iride.</li>
	<li>Eseguire la perfusione transcardica con circa 75 mL di 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>Continuare la perfusione transcardica con circa 100 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% tamponata in 1x PBS.</li>
	<li>Rimuovere il cervello dal cranio usando una pinica.</li>
	<li>Posizionare il cervello in posizione sagittale e tagliare in 4 sezioni uguali (circa 3 mm di larghezza) usando una lama di rasoio e una matrice cerebrale di ratto.</li>
	<li>Fissare ogni sezione in PFA al 4% in 1x PBS in un tubo di plastica sigillato da 5 ml durante la notte a 4 °C su uno shaker.</li>
	<li>Continuare a fissare in 4% PFA in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) su uno shaker per 1 ora.</li>
	<li>Lavare ogni sezione con 1x PBS a RT per 30 min, 3 volte.</li>
</ol>3. Disidratazione e depigmentazione
<ol><li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in metanolo al 100% per 1 ora a RT. Ripetere con più metanolo al 100%, incubando per 1 ora a RT.</li>
	<li>Raffreddare il campione in metanolo al 100% a 4° C per circa 10 min.</li>
	<li>Preparare una soluzione al 66% di diclorometano (DCM)/metanolo al 33%.</li>
	<li>Incubare il campione durante la notte nella soluzione DCM/metanolo a RT, con agitazione.</li>
	<li>Lavare con metanolo a RT per 30 minuti, 2 volte.</li>
	<li>Raffreddare il campione in metanolo al 100% a 4° C per circa 10 min.</li>
	<li>Candeggina in perossido di idrogeno al 5% refrigerato e appena preparato in metanolo durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in 1x PBS per 1 ora a RT.</li>
	<li>Lavare in soluzione 1 per 1 ora a RT, 2 volte.</li>
</ol>4. Etichettatura della subunità B della tossina del colera
<ol><li>Inserire la punta dell'ago di 1 mL di siringa nel sito del nucleo accumbens.</li>
	<li>Iniettare lentamente 2,5 μL di 1% di biotina-CTB su 20 s.</li>
	<li>Lasciare la punta dell'ago in posizione per 1 minuto e rimuovere lentamente oltre 10 s per evitare perdite.</li>
</ol>5. Applicazione di anticorpi
<ol><li>Incubare il campione in Soluzione 3 per 2 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Incubare il campione in Soluzione 4 per 2 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Incubare con anticorpo primario per 7 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Lavare in soluzione 2 per 5 volte, incubando 1 ora per lavaggio. Conservare nella soluzione 2 a RT durante la notte.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari per 7 giorni a 37 °C a bagnomaria.</li>
	<li>Lavare in soluzione 2 per 5 volte, incubando 1 ora per lavaggio; conservare nella soluzione 2 a RT durante la notte. NOTA: tutti i passaggi dalla versione 5.6 in poi, inclusa la conservazione finale, devono avvenire in condizioni di scarsa illuminazione. Le provette campione possono essere schermate con un foglio di alluminio. Le concentrazioni utilizzate per gli anticorpi in questo protocollo erano: TH a 1:100, Iba1 a 1:200 e l'anticorpo secondario a 1:100. Aggiungere la soluzione aggiuntiva 2 ai passaggi 5.1-5.6 per garantire che i tubi siano completamente riempiti.</li>
</ol>6. Pulizia dei tessuti
<ol><li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 20% di metanolo/80% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 40% di metanolo/60% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata al 60% di metanolo/40% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in una soluzione acquosa deionizzata all'80% di metanolo/20% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare il campione in metanolo al 100% per 1 ora a RT.</li>
	<li>Incubare in metanolo fresco al 100% durante la notte a RT.</li>
	<li>Incubare in 66% DCM/33% metanolo per 3 ore, con agitazione, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare in etere dibenzyl (DBE) senza agitare. Lasciare il campione in DBE fino a quando non è chiaro e memorizzare in DBE fino all'imaging.</li>
</ol>7. Montaggio
<ol><li>Ottieni una camera stampata in 3D in resina Visijet M3 Crystal (modelli disponibili sul sito web idisco.info).</li>
	<li>Fissare la camera a un vetrino per microscopio usando una resina epossidica.</li>
	<li>Posizionare il campione nello spazio quadrato al centro della camera.</li>
	<li>Riempire completamente la camera con DBE.</li>
	<li>Posizionare un coverslip di 0,17 mm di spessore sulla camera e applicare pressione fino a quando il coverslip non ha pieno contatto con le pareti della camera.</li>
	<li>Sigillare i bordi del coverslip alla camera usando la resina epossidica.</li>
	<li>Ruotare la camera per consentire alle bolle d'aria di fuoriuscire dall'ingresso di riempimento.</li>
	<li>Riempire la camera con DBE aggiuntivo.</li>
	<li>Sigillare l'ingresso di riempimento con resina epossidica e lasciare polimerizzare. NOTA: l'eccesso di DBE si riverserà durante il montaggio.</li>
</ol>8. Imaging
<ol><li>Utilizzare un sistema di microscopio confocale per eseguire z-scan con ingrandimento 4x (vedere il video 3Dallegato).</li>
	<li>Ottenere l'eccitazione fluorescente del campione utilizzando un set laser per emettere a una lunghezza d'onda simile alla lunghezza d'onda specificata dall'anticorpo secondario. L'eccitazione TH è stata ottenuta utilizzando un set laser HeNe per emettere a 632 nm.</li>
	<li>Impostare il rilevatore su una lunghezza d'onda vicina all'emissione laser. Per il presente protocollo, il rivelatore per TH è stato impostato a 650 nm.</li>
	<li>Aumentare il guadagno del rilevatore fino a quando non c'è un segnale visibile. Il guadagno di 650LP per le immagini è stato impostato su 7,50 B.</li>
	<li>Utilizzando l'opzione Scansione nel software di imaging confocale, spostare lo stadio del microscopio fino a quando il campione non viene messo a fuoco.</li>
	<li>Naviga intorno al tessuto in tutte le pianure e ottieni immagini singole o immagini z-stack utilizzando il software di imaging confocale.</li>
	<li>Una volta completata l'imaging, rimuovere il campione dalla camera. Rimetterlo in un tubo completamente riempito con DBE e conservarlo a RT in un luogo buio, preferibilmente coperto da un foglio di alluminio. NOTA: i campioni possono essere rimontati e ripresi finché il segnale di florescenza è ancora forte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

La pulizia dei tessuti offre una soluzione ai limiti del protocollo IHC tradizionale. Un campione trasparente riduce al minimo la dispersione e l'assorbimento della luce, che fornisce accesso ottico a livello cellulare ai tessuti intatti18,19. Le tecniche di pulizia dei tessuti trasformano un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione con la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campion...

Diverse tecniche di pulizia dei tessuti sono state convalidate per l'uso nel cervello: idrogel, idrofilo e idrofobo. Queste tecniche mirano a trasformare un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione attraverso la somministrazione di solventi. Una volta che l'indice di rifrazione del campione di tessuto corrisponde all'indice di rifrazione del mezzo di imaging scelto, è possibile ottenere un'immagine chiara del campione. Le tecniche a base di idrogel, come CLARITY, proteggono le biomolecole nel tessuto collegandole agli idrogel a base di acrilico, che prevengono danni strutturali e perdita di proteine1. Tuttavia, le tecniche di idrogel utilizzano sostanze chimiche aggressive che hanno il potenziale di danneggiare i tessuti più fragili e campioni di tessuto più densi potrebbero non essere compatibili con il protocollo idrogel. Alcune tecniche di idrogel possono richiedere attrezzature costose o portare all'espansione dei tessuti. Le tecniche idrofile, come CUBIC, preservano la struttura 3D attraverso la formazione di legami idrogeno all'interno del tessuto2. L'espansione tissutale può verificarsi anche in alcuni protocolli idrofili. La capacità di compensazione delle tecniche idrofile spesso non corrisponde alla capacità che hanno le tecniche idrofobiche, che è importante per i tessuti più densi e più spessi3.
Le tecniche idrofobiche sono solitamente veloci, non richiedono attrezzature speciali e producono un campione facile da maneggiare e conservare. iDISCO è una tecnica idrofoba che elimina il restringimento che può verificarsi in altri protocolli idrofobici. Originariamente, la tecnica di compensazione dei tessuti iDISCO è stata descritta da Renier et al.4 per gli embrioni e gli organi densi e adulti dei topi. Questa tecnica rimuove l'acqua dal tessuto nella fase iniziale di disidratazione, riducendo così la dispersione della luce. Il tessuto viene permeabilizzato durante il pretrattamento per consentire la penetrazione profonda degli anticorpi. I coloranti Alexa Fluor nello spettro rosso lontano sono utilizzati per l'immunolabeling per evitare l'autofluorescenza del tessuto a lunghezze d'onda inferiori5. I tessuti che sono stati sottoposti a protocolli di clearing idrofobico sono in grado di essere maneggiati facilmente e possono essere ripresi più volte grazie alla longevità dei coloranti Alexa Fluor. Se conservati correttamente, i tessuti possono fornire immagini per mesi o un anno dopo l'elaborazione iniziale.
Nel presente protocollo, l'anticorpo tirosina idrossilasi (TH), l'anticorpo Iba1 e la subunità B della tossina del colera (CTB) sono stati utilizzati sia sul cervello di ratto maschile che femminile e transgenico HIV-1 (Tg). Il ratto HIV-1 Tg possiede sette dei nove geni che compongono il genoma virale dell'HIV-1, che porta a un modello non infettivo di esposizione a lungo termine alla proteina HIV-16,7,8. Alterazioni dopaminergiche sono state precedentemente dimostrate nel ratto HIV-1 Tg e l'HIV-1 stesso è una malattia infiammatoria, quindi la scelta degli anticorpi era rilevante per il disegno sperimentale9,10,11,12. CTB è un tracciante che si attacca ai neuroni tramite il legame gangliosidico e può essere utilizzato per tracciare proiezioni afferenti nel cervello. La CTB è stata precedentemente utilizzata per studiare le proiezioni dal nucleo accumbens all'area della substantia nigra, due aree del cervello fortemente coinvolte con le vie dopaminergiche13,14,15.
In questo protocollo, TH servirà come marcatore per la produzione di dopamina e Iba1 segnerà la microglia attivata. L'anticorpo TH utilizzato etichetta selettivamente una singola banda a circa 62 kDa che corrisponde alla tirosina idrossilasi. L'anticorpo Iba1 corrisponde alla sequenza carbossi-terminale Iba1. Entrambi gli anticorpi sono stati allevati nel coniglio ed erano policlonali. La CTB sarà utilizzata per il tracciamento retrogrado dei neuroni dall'area del nucleo accumbens all'area della substantia nigra. L'attuale protocollo offre anche una linea guida per l'adeguamento del protocollo iDISCO originale in due modi distinti: 1) riduzione complessiva della colorazione di fondo modificando i reagenti sierici nelle fasi di blocco e 2) ridimensionamento del tempo di incubazione per essere adatto a campioni di tessuto più grandi. Nel complesso, il presente protocollo fornisce prove continue che le tecniche di clearing idrofobico sono fattibili nei tessuti cerebrali del ratto, non hanno interazioni dannose distinguibili con le proteine virali hiv-1 e sono compatibili con l'anticorpo TH, l'anticorpo Iba1 e il CTB.

<table><tbody><tr><td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 primary antibody</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoxy</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion machine</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pump variable flow</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH primary antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

I metodi di compensazione dei tessuti idrofobici sono procedure facilmente regolabili, veloci e a basso costo che consentono lo studio di una molecola di interesse in campioni di tessuto inalterati. Le tradizionali procedure di immunolabeling richiedono il taglio del campione in sezioni sottili, il che limita la capacità di etichettare ed esaminare le strutture intatte. Tuttavia, se il tessuto cerebrale può rimanere intatto durante l'elaborazione, le strutture e i circuiti possono rimanere intatti per l'analisi. I metodi di compensazione precedentemente stabiliti richiedono molto tempo per eliminare completamente il tessuto e le sostanze chimiche aggressive possono spesso danneggiare gli anticorpi sensibili. Il metodo iDISCO elimina rapidamente e completamente i tessuti, è compatibile con molti anticorpi e non richiede attrezzature di laboratorio speciali. Questa tecnica è stata inizialmente convalidata per l'uso nel tessuto dei topi, ma l'attuale protocollo adatta questo metodo agli emisferi di controllo e ai cervelli transgenici dei ratti. Oltre a questo, il presente protocollo apporta anche diverse modifiche al protocollo preesistente per fornire immagini più chiare con meno macchie di sfondo. Gli anticorpi per Iba-1 e tirosina idrossilasi sono stati convalidati nel ratto transgenico HIV-1 e nei ratti di controllo F344/N utilizzando l'attuale metodo di compensazione dei tessuti idrofobici. Il cervello è una rete intrecciata, in cui le strutture lavorano insieme più spesso che separatamente l'una dall'altra. Analizzare il cervello come un intero sistema rispetto a una combinazione di singoli pezzi è il più grande vantaggio di questo metodo di compensazione dell'intero cervello.

La completa eliminazione di ampie sezioni di tessuto cerebrale di ratto F344 / N e HIV-1 è stata ottenuta utilizzando questo protocollo di compensazione del tessuto idrofobico modificato. La Figura 1 mostra una tipica immagine confocale per TH nella regione substantia nigra. La Figura 1A rappresenta una colorazione densa e positiva. Aree dense come queste possono essere analizzate concentrandosi attraverso il piano "Z" per confermare la colorazione positiva e l...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Views.  University of South Carolina. Qui presentiamo un metodo di compensazione del tessuto idrofobico che consente la visualizzazione di molecole bersaglio come parte di strutture cerebrali intatte. Questa tecnica è stata ora convalidata per il controllo F344 / N e ratti transgenici HIV-1 di entrambi i sessi.

Video: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-occlusione di vasi / Ipotensione: un modello di ratto di Global Ischemia cerebrale

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Ricerca

Medicina

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Supporto metabolico di asportato, tessuti di cervello viventi durante l'acquisizione di microscopia a risonanza magnetica

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Bioingegneria

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimazione di DAN Matrix per la rilevazione e visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto Tissue per MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Neuroscienze

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Un metodo basati su Micro-CT per la caratterizzazione di lesioni e posizionamento elettrodi nel cervello degli animali piccoli

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred microliters of autologous blood was taken from the tail vein and stereotaxically injected into the pons. The injection process was divided into 2 steps: First, 10 &#181;L of blood was injected into a specific location, anteroposterior position (AP) -9.0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9.2 mm, followed by a second injection of the residual blood located at AP -9.0 mm; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm with a 20-minute interval. The balance beam test, limb placement test, and the modified Voestch neuroscore were used to evaluate neurological function. Magnetic Resonance Imaging (MRI) was used to assess the volume of hemorrhage in vivo. The symptoms of this model were in line with patients with massive pontine hemorrhage.

We present a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat via dual injection of autologous blood.

Emorragia pontina massiccia per doppia iniezione di sangue autologo

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Imaging e quantificazione di dendriti neuronali intatti tramite CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

Indagine sull'interazione spaziale tra astrociti e neuroni nel cervello eliminato

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Extraction and Tissue Clearing Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, neuronal connectivity, and molecular dynamics. Traditional methodologies for investigating the entire brain and spinal cord often involve isolating, sectioning, and scanning tissue slices, followed by the labor-intensive process of three-dimensional image reconstruction. This conventional approach can be both time-consuming and cumbersome. Advancements in tissue clearing and whole-organ imaging techniques have revolutionized the analysis of the entire brain and spinal cord. To maximize the potential of these innovative methods, it is essential to extract and clear brain samples while maintaining their connection to the spinal cord. This protocol provides a detailed and systematic guide for preparing samples of the brain connected to the spinal cord, outlining the extraction and clearing procedures. By streamlining these processes, this approach significantly enhances experimental efficiency and data integrity, thereby fostering advancements in neuroscience research and enabling more comprehensive investigations into the complexities of the central nervous system.

This study presents a protocol for extracting and preparing cleared whole-brain and spinal cord samples with preserved fluorescent signals, enhancing experimental efficiency and data integrity to advance neuroscience research.

Estrazione e pulizia dei tessuti Preparazione di campioni di cervello e midollo spinale di topo

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for a Rat Brain Tissue Sample

<a href='https://app.jove.com/v/61821/a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue'>Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).</a>This video demonstrates the method of hydrophobic tissue clearing of a rat brain tissue sample. The sample is sequentially dehydrated in methanol, treated with a dichloromethane and methanol mixture to dissolve lipids and pigments, and transferred to dibenzyl ether for complete tissue clearing, enabling detailed imaging without thin sectioning.

Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

Un metodo per l'isolamento delle unità neurovascolari dal cervello di ratto

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...