Presentiamo un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal tessuto cerebrale raccolte da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resettiva. Questa coltura è suscettibile di eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare o immunoistochimica. Si prevede che contribuirà alla spiegazione del meccanismo alla base della neurodegenerazione nelle malattie cerebrali associate.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un'alternativa più semplice ed economica al classico protocollo di coltura delle fette utilizzando inserti a membrana. Sebbene il protocollo complessivo non sia complesso, alcuni passaggi come la rimozione delle meningi, l'incollaggio del tessuto al disco del campione di vibratomo e la resezione per l'immunoistochimica sono meglio compresi quando dimostrati visivamente. A dimostrare la procedura saranno Niele Mendes e Glaucia Almedia, studentesse laureate, e Giovanna Nogueira, un'altra studentessa laureata.
Per iniziare questa procedura, aggiungere sale a un secchio di ghiaccio. Trasferire la soluzione di affezione in questo secchio e lasciarlo riposare sotto la miscela di carbogeno gorgogliando per almeno 20 minuti prima dell'uso. Quindi, preparare un blocco di 3%agarosio che è di circa due centimetri per due centimetri per due centimetri.
Super incollare il blocco di agarosio al disco del campione di vibratomo al fine di creare ulteriore supporto meccanico al campione di tessuto durante l'affettamento. Sul vibratoma, impostare lo spessore della sezione su 200 micrometri, la frequenza di vibrazione a 100 hertz e scegliere una velocità di affezione compresa tra 0,5 e 1,0 millimetri al secondo. Quindi bloccare il vassoio tampone del vibratomo alla base del vibratomo e aggiungere ghiaccio per mantenerlo refrigerato prima di ricevere la soluzione di affezione e il campione e durante tutta la procedura di affezione.
In primo luogo, impostare un apparecchio di trasporto costituito da una bombola di gas portatile contenente una miscela di carbogeno collegata a una valvola di flusso di pressione che controlli l'uscita del gas collegata ai tubi in silicone che collega tale uscita di gas alla nave da trasporto e alla nave da trasporto che contiene la soluzione di trasporto e il ghiaccio per il raffreddamento del campione durante il trasporto. Raccogliere e trasportare il campione e il trasporto come indicato nel protocollo di testo. Trasferire il campione in una piastra di Petri contenente soluzione di affettamento.
Utilizzando strumenti chirurgici fini, rimuovere con cura il maggior numero possibile di meningi rimanenti. Scegli il miglior orientamento del campione per la produzione di fette con le particolari caratteristiche del design sperimentale e usa una lama bisturi numero 24 per tagliare una superficie piana per essere la base che verrà incollata al disco del campione. Utilizzando un cucchiaio di plastica per lo smaltimento e delicati pennelli, raccogliere il frammento dalla piastra di Petri e asciugare la soluzione in eccesso con carta da filtro.
Successivamente, utilizzare la super colla per attaccare il tessuto al piatto del campione di vibratomo fino a quando non viene saldamente aderito al piatto e a contatto con il blocco di agarosio. Posizionare il disco del campione del vibratomo nel vassoio tampone del vibratomo. Bloccare il portastella in posizione con la lama del rasoio saldamente fissata.
Aggiungere la soluzione di affettamento e assicurarsi che copra sia il campione che la lama. Quindi inizia a affettare il campione in 200 fette di micrometro. Trasferire le fette dal vassoio tampone a una piastra di Petri contenente soluzione di affettare e tagliare eventuali bordi sciolti e materia bianca in eccesso a una proporzione di circa il 70% di corteccia e 30% di materia bianca.
In un armadio a flusso laminare, aggiungere 600 microlitri di mezzo di coltura ad ogni pozzo di una piastra da 24 po 'e incubare a 36 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per almeno 20 minuti prima di placcare le fette. Dopo questo, utilizzare un pennello per placcare una fetta in ogni pozzo. Se ci sono pozzi inutilizzati nel piatto, riempili con 400 microlitri di acqua sterile.
Incubare a 36 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Integrare 10 millilitri del mezzo di coltura precedentemente preparato con fattore neurotrofico derivato dal cervello ad una concentrazione di 50 nanogrammi per millilitro. Dopo otto o 16 ore, rimuovere 333 microlitri del mezzo condizionato da ogni pozzo e aggiungere 133 microlitri di mezzo fresco integrato con BDNF.
Sostituire un terzo del mezzo condizionato con un mezzo fresco integrato con BDNF ogni 24 ore. In primo luogo, trasferire le fette dai pozzali contenenti mezzo di coltura a una nuova piastra da 24 pozza contenente PBS. Rimuovere il PBS da ogni pozzo e sostituirlo con un millilitro di paraformaldeide al 4%.
Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere con cura la paraformaldeide dai pozzi e sostituirla con un millilitro di soluzione di saccarosio al 30%. Incubare a quattro gradi Celsius per 48 ore.
Dopo 48 ore, impostare il microtomo di congelamento su -40 gradi Celsius. Preparare una base di saccarosio sullo stadio del microtomo in cui devono essere posizionate le fette. Dopo che è stato completamente congelato, tagliare parte del saccarosio congelato per produrre una superficie piana su cui verrà posizionata la fetta.
Quindi, posizionare ogni fetta su una pellicola di plastica allungata e utilizzare un pennello per appiattire il tessuto. In un'unica mossa, trasferire la fetta allungata alla base di saccarosio congelata. Dopo che la fetta si è riposata per cinque o 10 minuti per congelare correttamente, tagliare la fetta in sezioni di 30 micrometri.
Trasferire le sezioni di 30 micrometri in una piastra di Petri contenente PBS e procedere ad un protocollo istologico adeguato alla progettazione sperimentale. Nel determinare la qualità e la salute delle fette coltivate, un aspetto critico da valutare è la presenza e la morfologia tipica dei tipi di cellule neurali, dei neuroni e delle cellule gliali previsti. L'architettura tipica della laminazione corticale umana si osserva in una fetta al giorno in vitro quattro rivelata dall'immunoetichettatura neuronale.
Inoltre, si osserva anche la presenza prevista di microglia e astroglia. Questi risultati dimostrano che l'architettura tissutale non è influenzata in modo significativo né dalla procedura chirurgica, né dalla lavorazione del campione, né dal periodo a breve termine in vitro. La risposta neuronale alla depolarizzazione indotta dal cloruro di potassio è stata quantificata anche in fette coltivate seguendo la fosforilazione ERK.
È interessante notare che un chiaro aumento della fosforilazione ERK è visto nelle fette trattate con cloruro di potassio al giorno in vitro quattro. Infine, la risposta delle fette al giorno in vitro quattro a una sfida tossica viene valutata con un noto perossido di idrogeno che induce stress ossidativo. Esporre le fette a 300 millimolare di perossido di idrogeno per 24 ore ha portato a una robusta diminuzione della riduzione dell'MTT.
Nel complesso, la massiccia morte cellulare osservata in giornata in vitro cinque fette dopo la sfida del perossido di idrogeno e i risultati della depolarizzazione indotta dal cloruro di potassio indicano la salute generale preservata delle fette al giorno in vitro quattro che rispondono a uno stimolo tossico come lo stress ossidativo. Questo protocollo è dedicato principalmente a studi basati su saggi della durata di una settimana come lo studio dei meccanismi molecolari della neurotossicità e della neuroprotezione da parte dei farmaci candidati. Sebbene questo protocollo sia dedicato all'uso di tessuto corticale raccolto da pazienti sottoposti a trattamento chirurgico per l'epilessia del lobo temporale micro resistente, è probabile che il tessuto raccolto da altre regioni o condizioni cerebrali possa anche essere fonte per produrre colture di fette galleggianti libere.
Le colture di fette del cervello umano adulto possono essere fondamentali per far progredire la nostra comprensione delle neuropatiologie umane a causa dei loro circuiti cellulari unici e dei macchinari molecolari privi di fette prodotte dal cervello dei roditori.
