ROMA può discriminare tra organoidi di soggetti con e senza fibrosi cistica quando si riscontrano meno di due mutazioni CFTR che causano malattie e quando il fluoruro di sudore è intermedio. ROMA può essere eseguita a tutte le età e con bassi tassi di complicanze. L'analisi è semi-automatizzata e standardizzata e le biopsie possono essere inviate a un laboratorio centrale per l'analisi.
Gli organoidi utilizzati per ROMA possono anche essere utilizzati per accedere all'efficacia modulatoria CFTR e ROMA potrebbe aiutare a misurare il grado di ripristino della funzione CFTR. Un giorno dopo la placcatura, colorare gli organoidi con verde calcio. Ruotare e inclinare leggermente la piastra con il coperchio acceso alcune volte per garantire una distribuzione omogenea del verde calcio in tutto il pozzetto.
Incubare nuovamente la piastra, per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per garantire la colorazione di tutti gli organoidi nei pozzetti. Per concentrarsi sugli organoidi, determinare la posizione ottimale X e Y e concentrarsi manualmente sugli organoidi in ciascun pozzetto, utilizzando il microscopio confocale. E salva queste posizioni nel software di imaging.
Successivamente, utilizzando le impostazioni di imaging delle cellule vive, impostare l'emissione a 488 nanometri e l'eccitazione a 515 nanometri e un obiettivo di ingrandimento LD a 5X. Per acquisire immagini organoidi, scattare immagini in modo direzionale unitario con una risoluzione di 1024 pixel per 1024 pixel e una profondità di 16 bit con il microscopio confocale. Scegli l'intensità laser e il guadagno principale per una visualizzazione ottimale delle differenze morfologiche tra fibrosi cistica e organoidi di fibrosi non cistica.
Avvia l'esperimento per acquisire le immagini. Successivamente, salva un'immagine per pozzetto per tutti i 32 pozzetti nel formato microscopio ed esportali come file TIFF. Innanzitutto, caricare i file TIFF nel software di analisi delle immagini e quindi eseguire il primo controllo di qualità in base ai criteri di esclusione determinati dall'operatore.
Escludere l'insieme delle immagini se sono presenti molte strutture o detriti differenziati o morti quando la densità di placcatura è inadeguata, quando sono presenti troppi o troppo pochi organoidi e in caso di distribuzione inadeguata della fluorescenza. Per preparare le immagini per l'analisi, creare e aprire un file di dati di rete di tutte le 32 immagini per ogni coltura organoide, consentendo l'analisi simultanea di tutte le 32 immagini per soggetto. E ricalibrare le immagini in modo che un pixel corrisponda a 2,5 per 2,5 micrometri.
Quindi, delineare le strutture utilizzando una soglia di intensità inferiore di 4.500 e una soglia superiore di 65.535, disattivando le funzioni lisce e pulite, attivando la funzione dei fori di riempimento e mettendo la funzione separata a 3X. Per contare gli organoidi, selezionare tutte le strutture superiori o uguali a 40 micrometri. Quindi, fai clic sul pulsante di aggiornamento della misurazione ND e gli organoidi contati verranno numerati.
Per misurare l'intensità e la circolarità per il calcolo, selezionare tutte le strutture superiori o uguali a 60 micrometri e contare. Quindi, rimuovere tutte le strutture che toccano i bordi dell'immagine. Quindi, erodere un pixel dal bordo di ciascuna struttura, più o uguale a 60 micrometri, e misurare l'intensità media di ciascuna struttura.
Successivamente, selezionate nuovamente tutte le strutture superiori o uguali a 60 micrometri ed erodete 10 pixel dal bordo di ciascuna struttura, superiore o uguale a 60 micrometri. Quindi, misurare l'intensità media di ogni struttura erosa e la circolarità di ciascuna struttura. Quindi, calcolare il rapporto di intensità dividendo la misurazione dell'intensità dopo aver eroso 25 micrometri dal bordo di ciascuna struttura, più o uguale a 60 micrometri per la media della misurazione dell'intensità dopo aver eroso 2,5 micrometri dal bordo di ciascuna, più o uguale a 60 micrometri struttura.
Eseguire il secondo controllo di qualità in base ai criteri di esclusione determinati dal software come descritto nel manoscritto. Sono stati raccolti e fotografati organoidi di 212 soggetti. Dopo l'esclusione di 23 serie di immagini, sono state analizzate immagini organoidi di 167 soggetti con fibrosi cistica e due mutazioni CFTR che causano malattie e di 22 soggetti di fibrosi non cistica, il numero medio di organoidi per coltura è risultato essere 1.519.
Il rapporto di intensità e l'indice di circolarità sono stati determinati per organoidi di soggetti con e senza fibrosi cistica. Utilizzando questi due indici, è stata ottenuta una perfetta discriminazione tra organoidi di soggetti con e senza fibrosi cistica non solo quando si utilizzano i dati di tutti i 32 pozzi, ma anche quando otto pozzi sono stati scelti casualmente per ogni coltura. Sono stati ottenuti istogrammi per quattro colture illustrative, che mostrano la distribuzione dei valori per la circolarità, l'intensità della parte centrale dell'organoide e l'intensità dell'intero organoide.
Il controllo di qualità è essenziale, poiché sono necessarie immagini di alta qualità per un calcolo accurato del rapporto di intensità e dell'indice di circolarità. Le colture organoidi stabilite per ROMA possono anche essere utilizzate come ausili fisici per testare l'effetto del trattamento CFTR. RNA, DNA e proteine possono essere estratti per un'ulteriore caratterizzazione delle varianti CFTR.
