Vorremmo riconoscere la struttura di laboratorio FCCC animali per il loro sostegno in questo progetto. Ringraziamo Wolfe Laboratories, Inc. per la loro assistenza nell&#39;analisi dei livelli di paclitaxel nel plasma e nei tessuti. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health sovvenzioni K01CA120091 a EHB, e CA06927 al Fox Chase Cancer Center.

Questo protocollo è stato approvato dal Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee Fox Chase e dal Fondo animali da laboratorio, ed è risultato essere in accordo con le linee guida istituzionali per il trattamento umano degli animali. 1. Preparazione preliminare <ol><li> Preparazione del catetere: Preparare un catetere da un breve tratto di tubo in polietilene, modificato per formare un assottigliata, estremità smussata (Figura 3A). Rendere più cateteri in anticipo e risparmiare tempo indeterminato. <ol><li> Accendi un becco Bunsen, e regolare di stabilire una fiamma bassa costante. Tenere tubi vicino alla fiamma per ammorbidire polietilene. Quando il tubo inizia a sciogliersi, lentamente separare le due estremità per creare una sezione assottigliata di tubo, circa 0,25 mm di diametro esterno. </li><li> Tagliare un estremità smussata circa 0,75 cm lungo sezione sottile. Questo assicura tubo sufficiente per essere fissato in arteria, senza creare un catetere eccessivamente lunga. NOTA: A fine sottile lungo su The il catetere ha una propensione a intasare. Un eccessivamente lungo termine può anche detenere abbastanza liquido per cambiare in modo significativo la capacità di volume del liquido del catetere. </li><li> Smussare l&#39;estremità smussata passando rapidamente attraverso la fiamma - se correttamente riscaldato, alla fine diventa un po &#39;arrotondata e allargata. I ganci punta leggermente indietro, che aiuta ancorare il tubo durante l&#39;inserimento nell&#39;arteria. </li><li> Tagliare il tubo 6,0 centimetri dal punto in cui inizia a sottile. Questo rende un catetere molto maneggevole, che è abbastanza a lungo per il filo attraverso per uscire dal collo e di tenere e lavorare con comodo, ma abbastanza breve per impedire che il mouse da rosicchiare tubo in eccesso o che richiedono troppo volume di infusione in più per cancellare salina iniziale . </li><li> Preparare una siringa di circa 0,2 ml di soluzione di eparina, sormontato da un ago smussato. Inserire l&#39;ago nella estremità larga del catetere (Figura 3B). Riempire il catetere con eparina, facendo attenzione al fine di garantire che non vi siano bolle inil tubo. Impostare la siringa eparina e il catetere parte su una zona sterile. Sterilizzare cateteri con raggi gamma, ponendo catetere (s) in una capsula di Petri, ed esponendo a 20 Gy di raggi gamma. Se non si ha accesso a una fonte di radiazioni gamma, controllare con il vostro impianto di animali per indagare altri mezzi di sterilizzazione, come ad esempio a gas o chimico-sterilizzazione. Non sterilizzare in autoclave, il polietilene non può essere sterilizzato a caldo. </li></ol></li><li> Creazione di un cavo salina (Figura 3B). <ol><li> Preparare una seconda siringa di circa 0,5 ml di soluzione fisiologica sterile, facendo attenzione al fine di garantire una linea priva di bolle. </li><li> Tagliare un secondo pezzo di tubo, di circa 15 cm e scivolare sulla siringa smussata. Attaccare una porta del connettore all&#39;estremità libera del tubo. </li><li> Verificare che il flusso di soluzione salina è libera da intoppi avanzare un piccolo volume di soluzione salina attraverso il cavo. Utilizzare questo cavo salina dopo l&#39;inserimento del catetere, per controllare il flusso attraversoil catetere, e lavare la linea di sangue. Impostare la siringa salina parte su una zona sterile. </li></ol></li><li> Prima di un intervento chirurgico, sterilizzare attrezzature in autoclave, o in alternativa alla sterilizzazione a gas o perle di vetro di sterilizzazione. </li><li> Preparare area chirurgica sterile. <ol><li> Pulire le superfici da banco e microscopio con un disinfettante come ad esempio il 70% di etanolo o biossido di cloro. Coprire panchina e base del microscopio con una usa e getta, tampone assorbente pulita. </li><li> Preparare una scheda chirurgico coprendo con due strati di pulito, carta assorbente, collegati in modo sicuro con nastro adesivo. </li></ol></li><li> Disporre tutte le forniture chirurgiche (come catalogato in Materials List) in modo che siano facilmente accessibili. <ol><li> Tagliare tre lunghezze di sutura sterile, a 8 cm ciascuno, e mettere da parte con altre forniture. Inserire un porto dove sarà facilmente disponibile (Figura 3B). </li></ol></li></ol> 2. Chirurgia <ol><li> Preparazione dell&#39;animale <ol><li> AnesthMouse etize dall&#39;esposizione al 2-3% isoflurano nella camera anestesia collegata alla precisione vaporizzatore. Estrarre il mouse dalla camera, e radersi i capelli dal collo / parte superiore del busto del topo, e sotto l&#39;orecchio destro (sito di uscita del catetere). Somministrare veterinaria vaselina pomata oftalmica per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Assicurarsi che l&#39;animale non svegliare durante preparazioni chirurgiche consentendo topo tempo sufficiente nella camera di inalazione prima prep (almeno due minuti), o somministrando isoflurano al topo mediante un cono di naso durante prep. Ritorna mouse per camera di anestesia. </li><li> Quando il mouse è sufficientemente inerte, spostarsi in area chirurgica sterile, collocare cono anestesia sopra il naso e la bocca del topo, e deviare il flusso di isoflurano a cono. Verificare che l&#39;anestesia pizzicando zampa con una pinza; quando il mouse non reagisce, procedere al passaggio successivo. </li><li> Posizionare il mouse sul dorso, con la testa rivolta verso ilinvestigatore. Fissare le orecchie, le zampe anteriori e posteriori, zampe a bordo chirurgico con nastro adesivo o altro apparecchio di contenzione per mantenere costante il mouse. Pulire l&#39;area di incisione con povidone-iodio e il 70% di etanolo. </li></ol></li><li> Isolamento di carotide <ol><li> Fai da 1 cm longitudinale tagliato leggermente a destra della linea mediana del collo. Usare pinze per separare grasso e muscolo per esporre la trachea (Figura 4A). Individuare la carotide che corre parallela alla trachea (Figura 4B). </li><li> Usare con cautela pinze a fascia separato sovrastante l&#39;arteria (Figura 4C). Leggermente tirare il nervo vago parte la carotide e inserire pinze nello spazio tra. Pinza delicatamente aperte per creare un vuoto nella fascia, e tirare accuratamente lontano nervo dalla arteria, dalla forcella nell&#39;arteria vicino alla laringe (estremità anteriore), alto (posteriore) per quanto possibile (almeno 3 mm) ( Figura 4D). </li><li> Sgombrare il campo da qualsiasi rerimanente fascia fino a quando l&#39;arteria è ben isolato (Figura 4E). Aggiungere una goccia di soluzione salina all&#39;area chirurgico occasionalmente per mantenere il tessuto umido, e quindi meno fragile e meno soggetto a strappi casuale. </li></ol></li><li> Sutura e preparazione arteria per l&#39;inserimento del catetere (figure 4, 5). <ol><li> Usare pinze per disegnare un filo di sutura di seta sotto l&#39;arteria. Legare un nodo sicuro per chiudere l&#39;arteria fino verso la parte anteriore il più possibile (Figura 4F). </li><li> Disegnare un secondo filo sotto l&#39;arteria. Fare un nodo a scomparsa per chiudere temporaneamente l&#39;arteria fino verso la parte posteriore il più possibile (Figura 4F). </li><li> Disegnare un terzo filo sotto l&#39;arteria. Un nodo molto sciolto tra i primi due punti di sutura, da utilizzare per fissare rapidamente il catetere dopo l&#39;inserimento (Figura 4G). </li><li> Tenere le estremità di tutte le suture fuori del modo bagnandoli con un po &#39;di etanolo al 70%. </li></ol></li><li&gt; inserimento del catetere <ol><li> Con la sutura, afferrare il nodo in basso per tirare l&#39;arteria leggermente teso. Nick l&#39;arteria sopra, ma molto vicino, la sutura anteriore (Figura 4H). Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità, ma controllare la fessura per assicurarsi che l&#39;apertura è ostruita. </li><li> Rimuovere il catetere eparina-riempita dall&#39;ago della siringa, cercando di evitare di creare ampie sacche di aria alle due estremità. Manipolare il catetere per posizionare smussatura in un angolo comodo, generalmente verso il basso, e leggermente a destra (per giocatori destri). </li><li> Tenendo al sutura per mantenere l&#39;arteria restante leggermente teso, inserire delicatamente il catetere nella fessura (Figura 4I). Utilizzare le pinze per tenere la sutura anteriore e tirare l&#39;arteria giù sopra catetere (spingendo eccessivamente con il catetere può causare l&#39;estremità smussata per forare l&#39;arteria). Staccare con cautela il catetere e anteriore sutura. </li></ol></li><li> Protezione di catetere e l&#39;inizio del flusso sanguigno (Figure 4J, 5B). <ol><li> Fissare il catetere stringendo il nodo della sutura centrale, vicino all&#39;ingresso del catetere nell&#39;arteria. Fare un nodo triplo stretto, ma essere sicuri di non tirare così stretto da ostruire il flusso attraverso il catetere. Ulteriori fissare il catetere legando il basso con la sutura anteriore, sotto l&#39;entrata all&#39;arteria. </li><li> Attaccare il cavo salina al catetere attraverso il connettore, sempre cercando di evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria nella linea. </li><li> Afferrare le estremità della sutura posteriore e tirare delicatamente per rilasciare il nodo. Manovra la sutura giù l&#39;arteria, sull&#39;estremità del catetere (non rimuovere il filo). Il sangue deve scorrere nel catetere; se non c&#39;è flusso di sangue, muovere delicatamente il catetere per tentare di rimuovere la costrizione. </li><li> Quando il flusso appare ostruito, utilizzare l&#39;ultimo filo (dalla sutura posteriore) per legare un nodo in più, un po &#39;al di sopra della sutura centrale. </li></ol></li><li> Tesigillatura mporary di catetere. Lavare il catetere di sangue, quindi utilizzare un emostatico per bloccare l&#39;estremità del catetere vicino al connettore. Rimuovere il connettore e sostituirlo con il tappo per sigillare l&#39;estremità del catetere, e rimuovere la pinza emostatica. </li><li> Riposizionare il catetere per uscire dal retro del collo. <ol><li> Con pinze in ogni mano, utilizzare una coppia di pinze a mantenere il catetere appena sotto la sutura anteriore, e con l&#39;altra, premere un nodo nel catetere quindi sarà facilmente piegare a lato. Ripetere la procedura per creare un secondo nodo. Questo permette l&#39;estremità libera del catetere di essere tirato verso il retro della testa del topo, senza forzare la punta del catetere per girare lateralmente contro la parete dell&#39;arteria. </li><li> Capovolgere il mouse sulla sua (a sinistra) lato, mantenendo il cono posizionato sopra la bocca e il naso, e pulire l&#39;area di incisione con il 70% di etanolo e povidone-iodio. Effettuare una piccola incisione (circa 4 mm) al di sotto e dietro l&#39;orecchio destro. </li&gt; <li> Usare pinze per tenere il lembo aperto di pelle, mentre lavora la sonda cava smussato sotto la pelle per creare un canale attraverso la guancia, alla cavità al collo. Si consiglia di portare la sonda intorno alla ghiandola salivare, invece di cercare di passare fra la boccola e la pelle. Usare pinze per liberare con cura uno spazio per la sonda per uscire. </li><li> Infilare la spina della porta / catetere attraverso la sonda per uscire in collo. Non tirare troppo forte; essere sicuri che il catetere non schiaccia o costrizione dei vasi sanguigni o organi. </li></ol></li><li> Chiusura e recupero. Somministrare analgesico topico (ad esempio bupivacaina) per l&#39;incisione spalla, e coprire la ferita con acqua-prova, nastro adesivo chirurgico. Applicare un secondo pezzo di nastro adesivo per fissare ulteriormente il catetere. <ol><li> Somministrare analgesico topico per l&#39;incisione del torace, e chiudere ferita con seta o punti metallici. </li><li> Rimuovere mouse da anestesia, e consentire all&#39;animale di riprendersi in un ambiente pulito, riscaldato spazio (luogo gabbia in cima ad una piastra elettricao sotto una lampada di calore), per almeno 30 min. </li></ol></li></ol> 3. Infusione <ol><li> Preparare aliquote di 5 mg / ml soluzione di paclitaxel / metanolo. <ol><li> Misura 50 mg di paclitaxel in una provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 10 ml di metanolo sterile. Tappare la provetta. Ruotare a mano o su un agitatore rotante a temperatura ambiente fino dissoluzione della polvere. </li><li> Aliquota 500 ml di soluzione in 20 piccolo, congelatore tubi di sicurezza, e conservare a -20 ° C. </li><li> Scongelare un&#39;aliquota individuale a temperatura ambiente o 37 ° C bagnomaria, immediatamente prima dell&#39;infusione. </li></ol></li><li> Preparare la pompa di infusione (Figura 6). <ol><li> Tagliare un lungo tratto di tubo di polietilene di circa 40 cm. Attaccare un ago smussato ad una estremità, ed una porta del connettore all&#39;altra. </li><li> Elaborare farmaco in una siringa con una nota interna di diametro (la maggior parte delle pompe programmabili richiederanno il diametro del corpo della siringa, per calcolare la velocità di the il braccio della pompa). Applicare l&#39;ago alla siringa e caricare la droga attraverso l&#39;ago e il tubo. </li><li> Collocare la siringa nella pompa secondo le istruzioni del produttore. Primo la pompa in modo che il farmaco fluisce uniformemente la spina del connettore, ed è pronta per infusione. </li></ol></li><li> Collegare il mouse alla pompa. <ol><li> Tenere il mouse costante e usare la pinza emostatica per bloccare il catetere, vicino al tappo. Rimuovere il tappo e sostituire con il connettore attaccato alla siringa e il tubo. NOTA: Il sangue può cominciare a scorrere indietro attraverso il tubo. </li><li> Somministrare rapidamente una pompa veloce per cancellare il volume del catetere (calcolato empiricamente osservando il volume di 6 cm di tubo), quindi passare immediatamente alla velocità di infusione desiderata. </li></ol></li><li> Continuare Paclitaxel infusione per il corso di tre ora. <ol><li> Monitorare tubi di tanto in tanto per controllare eventuali perdite in corrispondenza dei nodi come questo è spesso un segno di un blocco nel flusso al mouse.Guarda il mouse per reazioni attese o inattese per infusione (letargia o iperattività, segni di disagio). </li><li> A seconda della durata e della natura del l&#39;infusione, il mouse potrebbe non mangiare o bere, ma essere sicuri di fornire l&#39;accesso al cibo e all&#39;acqua in base alla politica stabilita dell&#39;istituzione. Essere consapevoli del potenziale per disidratare il topo attraverso la raccolta di grandi quantità di sangue. </li><li> Continuare a mantenere il caldo gabbia con una piastra elettrica o una lampada, a meno che il mouse sembra desiderare di stare lontano dal calore. Se l&#39;animale non è eutanasia all&#39;interno di diverse ore dopo l&#39;intervento chirurgico, attuare il piano per il trattamento post-chirurgico di animali, tra cui le condizioni abitative sterili e di trattamento per il dolore post-operatorio. </li><li> Mantenere una stretta vigilanza sul mouse, soprattutto nel primo pochi minuti, per assicurarsi che non tira fuori il tubo attraverso iperattività, o irritazione provocati dal tubo (che può essere un segno di un povero di inserimento). Se il mouse non è più attivo, monito costanteanello può non essere necessario, ma controllare il mouse regolarmente per essere sicuri che l&#39;animale non venga aggrovigliato nel tubo. Imbracatura e sistema di cavezza sono disponibili in commercio, ma il loro uso è oltre lo scopo di questo protocollo. </li></ol></li><li> Prelievo di campioni. <ol><li> Raccogliere campioni di sangue a intervalli regolari da parte di sanguinamenti sottomandibolari o retro-orbitale (Se il protocollo non fa uso di modelli tumorali mammarie, prendere in considerazione la raccolta di sangue attraverso un catetere giugulare inserito nello stesso momento in cui il catetere carotideo). Fare attenzione a non tirare la linea di infusione. Se la raccolta di sanguinamenti retro-orbitale, anestetizzare leggermente il mouse con un anestetico per inalazione (ad esempio metossifluorano) così uno non ha bisogno di afferrare per la collottola per fissare il mouse. </li><li> Spin sangue hemocrit centrifuga per separare le cellule del sangue dal plasma. Utilizzare una penna file o una punta di diamante per segnare il tubo a fronte della separazione di fase. Rompere il tubo e raccogliere il plasma solo, in piccolo, tubo freezer-safe. Conservare a -80 ° C fino all&#39;analisi. NOTA: Se una centrifuga hemocrit non è disponibile, trasferire il campione di sangue nella provetta micro-centrifuga, e centrifuga in una micro-centrifuga ad elevata velocità per separare le cellule del sangue dal plasma. Raccogliere il plasma in un secondo tubo, e conservare a -80 ° C. </li><li> Euthanize mouse CO 2 asfissia. Raccogliere tessuto (circa 20 - 50 mg) da organi di interesse e flash congelamento in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;analisi. </li></ol></li></ol> 4. Analisi del campione NOTA: Tutti i campioni di questo protocollo sono stati analizzati attraverso un laboratorio esterno mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC - MS / MS), che ha calcolato le concentrazioni di paclitaxel nel modo seguente: <ol><li> Estratto paclitaxel da campioni. Omogeneizzare campione di tessuto nello 0,1% di acido acetico, metanolo al 50% prima dell&#39;estrazione. Estrarre paclitaxel mediante estrazione liquido / liquido, usando metil ter-butil etere (MTBE) fortificato con uno standard di riferimento interno (docetaxel). Rimuovere MTBE e campioni secchi. Risospendere in 50% acetonitrile, soluzione allo 0,1% di acido acetico. </li><li> Preparare gli standard di calibrazione. Aggiungere una concentrazione nota di paclitaxel appropriarsi C57BL / 6 matrice per ottenere una serie finale di standard (da 1 a 20000 ng / ml per campioni di plasma, da 0,1 a 5000 ng / ml per campioni di tessuto). Estrarre standard in duplicato, utilizzando lo stesso metodo per i campioni di studio sopra. Misurare picco paclitaxel in campioni mediante HPLC / MS / MS utilizzando la ionizzazione elettrospray. </li><li> Calcolare la concentrazione utilizzando il rapporto di paclitaxel area standard interno. Utilizzare standard di calibrazione per creare una curva standard e campioni di studio interpolati dalla forma della curva. Normalizza concentrazione dei campioni di studio per il peso iniziale di campione prima omogeneizzazione. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Carotide infusione è una tecnica notevole in questo studio di farmacocinetica di paclitaxel. Carotide infusione è un metodo per distribuire rapidamente farmaco nel sistema circolatorio 14. Il 3 ore di infusione è una più stretta mimica di somministrazione clinica di farmaci come taxani di iniezioni in bolo. L&#39;intervento può essere eseguito in modo affidabile da un singolo individuo, il tempo di intervento è relativamente breve, e tassi di successo sono&gt; 75%. Dopo che i campioni sono raccolti, dev...

Infusione del farmaco attraverso la carotide può essere eseguito in modo affidabile e riproducibile ottimizzando attrezzature e tecniche. La procedura non è complicata, anche se richiede un controllo preciso e attenzione al dettaglio. Cura Superior e destrezza sono necessari per isolare l&#39;arteria carotide e inserire il catetere, che può generalmente essere acquisita attraverso la pratica. La chirurgia da parte di un tecnico esperto non deve superare un&#39;ora. Dopo l&#39;intervento chirurgico di successo, il mouse dovrebbe apparire normale e sano (anche se il mouse può reagire con l&#39;infusione effettivo droga), e di droga (s) può essere somministrato in una dose uniforme continua controllato. I campioni di sangue devono essere prelevati da un sito diverso da quello carotide; sanguinamenti retro-orbitale dimostrato facile da raccogliere e soddisfacente per l&#39;analisi delle concentrazioni di droga. Cateteri di dimensioni e la forma ottimale sono un bene prezioso per l&#39;esecuzione di una infusione di successo 11. Abbiamo trovato il cateteri disponibili commercially spesso di essere troppo grandi e / o troppo flessibile per consentire un comodo accesso all&#39;arteria carotide del mouse. Si è rivelato preferibile cateteri di moda dal tubo di polietilene utilizzato per collegare il mouse alla siringa di infusione. In questo modo, tutti i tubi, i connettori e gli aghi erano di dimensioni consistenti, che ha semplificato gruppo di infusione. Usando questa tecnica, non è necessario spingere la punta del catetere nell&#39;arteria oltre il punto in cui è ancora visibile, e il flusso di sangue al carotide non viene ripristinato fino a dopo il catetere viene inizialmente fissato. Questo riduce i rischi di puntura dell&#39;arteria o di avere il catetere spinto fuori dalla pressione del flusso sanguigno. Il design del catetere nel presente documento non incorpora un &quot;bump&quot; per tenerlo in posizione, in modo che fissano il catetere bene con punti di sutura e nastro adesivo chirurgico è una priorità. Infusi può essere preferibile per le iniezioni comuni iv bolo, come una migliore mimica di gestione clinica difarmaci come taxani 3, 12, 13. La tecnica qui descritta è stata sviluppata in origine per consentire infusione in modelli murini in cui l&#39;accesso alla vena giugulare o femorale è stata esclusa dalla crescita del tumore mammario e / o eccessiva vascolarizzazione della zona di inserimento. Questo metodo può spesso essere appropriato anche in topi privi di tumore: anche se isolando e CATETERISMO la carotide è un po &#39;più invasivo, abbiamo trovato preferibile alla giugulare, perché la propensione del muro giugulare per strappare portato a inserimenti più non riusciti e fallimenti per completare il periodo di tempo 3 ore. Mentre i risultati qui riportati sono da C57BL / 6J (in-house di razza) topi, abbiamo utilizzato questa tecnica per infondere con successo paclitaxel in diversi ceppi di topi, tra cui FVB e misti-ceppi, a seguire la farmacocinetica in modelli murini transgenically manipolati di down-regolare le funzioni cellulari trasportatore. I campioni di sangue e di tessuto raccolti hanno mostrato livelli attesi di paclitaxel, nella gamma dei livelli osservati dopo infusioni giugulari 1. Questa tecnica può essere previsto per funzionare altrettanto bene in altri modelli di topo e con altre soluzioni per infusione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="846">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:293px;">Table of specific reagents and equipment:</td>
			<td style="width:185px;">Source:</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Polyethylene tubing 0.024&#8221;OD X 0.011&#8221;ID&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">PE10</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Stainless steel port plug (30 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">NB-30</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">2 Stainless steel connector plugs (28 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">PP-28</td>
			<td style="width:259px;">Slightly larger than PE tubing ID, to fit snugly and keep a tight seal.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">3 Blunted needles (30 gauge)</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">C-30</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">3 1cc syringes</td>
			<td style="width:185px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:111px;">309659</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Sterile 0.9% Saline solution</td>
			<td style="width:185px;">Hospira</td>
			<td style="width:111px;">0409-7984-37</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Cath-Loc HGS Heparin/Glycerol Solution&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">HGS</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Silk suture</td>
			<td style="width:185px;">Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:111px;">SUT-S&#160;113</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Vanna Scissors (micro-scissors)</td>
			<td style="width:185px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">14122</td>
			<td style="width:259px;">This model has a curved tip, but straight-tip scissors work as well.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Hartman Mesquito Hemostatic Forceps</td>
			<td style="width:185px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:111px;">501705</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Betadine Swabsticks</td>
			<td style="width:185px;">Perdue Products L.P.</td>
			<td style="width:111px;">BSWS1S</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Bupivacaine</td>
			<td style="width:185px;">Hospira</td>
			<td style="width:111px;">0409-1160-01</td>
			<td style="width:259px;">May be replaced with Lidocaine, or similar local anesthesia.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Paclitaxel</td>
			<td style="width:185px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:111px;">P-9600</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Methanol</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">32213</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">Micro-Hematocrit Capillary Tubes, Heparinized</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">22-362-566</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">&#160;Capillary Tube Sealant&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-678</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:185px;">Fox Chase Cancer Center, Laboratory Animal Facility in-house-bred</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:293px;">API 4000 Q-Trap mass spetrometer</td>
			<td style="width:185px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

carotid artery infusions for pharmacokinetic and pharmacodynamic analysis of taxanes in mice

Nel proporre l&#39;uso di un farmaco, combinazione di farmaci, o la somministrazione di farmaci in un nuovo sistema, si deve valutare la farmacocinetica del farmaco nel modello di studio. Poiché l&#39;utilizzo di modelli murini sono spesso un passo fondamentale nella scoperta della droga preclinica e lo sviluppo di farmaci 1-8, è necessario progettare un sistema per introdurre la droga in topi in modo uniforme e riproducibile. Idealmente, il sistema dovrebbe consentire la raccolta di campioni di sangue a intervalli regolari per un corso di tempo impostato. La capacità di misurare concentrazioni di farmaco di spettrometria di massa, ha permesso agli investigatori di seguire le variazioni dei livelli plasmatici nel tempo nei topi individuale 1, 9, 10. In questo studio, paclitaxel è stata introdotta in topi transgenici in infusione arteriosa continua oltre tre ore, mentre i campioni di sangue sono stati prelevati simultaneamente da emorragie retro-orbitale in momenti insieme. Infusioni carotide sono una potenziale alternativa per infusioni vena giugulare, quando fattori cometumori mammari o altri ostacoli fanno infusi giugulari impraticabile. Usando questa tecnica, le concentrazioni di paclitaxel nel plasma e nel tessuto raggiunti livelli simili rispetto all&#39;infusione giugulare. In questo tutorial, mostreremo come cateterizzare con successo l&#39;arteria carotidea preparando un catetere ottimizzato per il singolo modello del mouse, quindi mostrare come inserire e fissare il catetere nell&#39;arteria carotide del mouse, infilare l&#39;estremità del catetere attraverso la parte posteriore del collo del mouse e collegare il mouse ad una pompa per fornire una velocità controllata di afflusso di droga. Sanguinamenti retro-orbitale a basso volume multipli consentono per l&#39;analisi delle concentrazioni plasmatiche del farmaco nel tempo.

<html> Distribuzione Paclitaxel segue schemi prevedibili nel corso di un regime di dosaggio 3 ore di 15 minuti di infusione ad alta velocità, seguita da una infusione di 165 min a bassa velocità. La figura 1 mostra un confronto di vena-infusione concentrazioni di paclitaxel nel plasma giugulare e carotide-infusioni. Le concentrazioni di paclitaxel scendono rapidamente nei primi 15 min a seguito di un elevato volume di infusione iniziale e quindi si stabilizzano nel prossimo...

Watch this Scientific Journal Video about Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice at JoVE.com

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Questo metodo è stato sviluppato con l&#39;obiettivo di fornire una soluzione di droga costante attraverso l&#39;arteria carotide, per valutare la farmacocinetica di nuovi farmaci in modelli murini.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

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Video: Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified version of carotid partial ligation methods [1,2] to show that it acutely induces low and oscillatory flow conditions, two key characteristics of disturbed flow, in the mouse common carotid artery. Using this model, we have provided direct evidence that disturbed flow indeed leads to rapid and robust atherosclerosis development in Apolipoprotein E knockout mouse [3]. We also developed a method of endothelial RNA preparation with high purity from the mouse carotid intima [3]. Using this mouse model and method, we found that partial ligation causes endothelial dysfunction in a week, followed by robust and rapid atheroma formation in two weeks in a hyperlipidemic mouse model along with features of complex lesion formation such as intraplaque neovascularization by four weeks. This rapid in vivo model and the endothelial RNA preparation method could be used to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases. Also, it could be used to test various therapeutic interventions targeting endothelial dysfunction and atherosclerosis in considerably reduced study duration.

This describes a partial carotid ligation surgery, which causes disturbed flow conditions and subsequent atherosclerosis development (in two weeks) with intraplaque neo-vascularization (in four weeks) in the mouse common carotid artery. We also describe a novel method of RNA isolation from the carotid intima, providing high purity endothelial RNA.

Un modello di Disturbed flusso indotta aterosclerosi carotidea in Arteria mouse da legatura parziale e un semplice metodo di isolamento dell&#39;RNA da Endotelio carotidea

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

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Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Corsa di modellazione in Mouse - Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale con il Modello Filament

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Tecnica modificata di legatura dell&#39;arteria coronarica in Mouse

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce atherosclerosis (reviewed in 1 and 2). The role of shear stress has been extensively studied in vitro investigating the influence of flow dynamics on cultured endothelial cells 1,3,4 and in vivo in larger animals and humans 1,5,6,7,8. However, highly reproducible small animal models allowing systematic investigation of the influence of shear stress on plaque development are rare. Recently, Nam et al. 9 introduced a mouse model in which the ligation of branches of the carotid artery creates a region of low and oscillatory flow. Although this model causes endothelial dysfunction and rapid formation of atherosclerotic lesions in hyperlipidemic mice, it cannot be excluded that the observed inflammatory response is, at least in part, a consequence of endothelial and/or vessel damage due to ligation.
In order to avoid such limitations, a shear stress modifying cuff has been developed based upon calculated fluid dynamics, whose cone shaped inner lumen was selected to create defined regions of low, high and oscillatory shear stress within the common carotid artery 10. By applying this model in Apolipoprotein E (ApoE) knockout mice fed a high cholesterol western type diet, vascular lesions develop upstream and downstream from the cuff. Their phenotype is correlated with the regional flow dynamics 11 as confirmed by in vivo Magnetic Resonance Imaging (MRI) 12: Low and laminar shear stress upstream of the cuff causes the formation of extensive plaques of a more vulnerable phenotype, whereas oscillatory shear stress downstream of the cuff induces stable atherosclerotic lesions 11. In those regions of high shear stress and high laminar flow within the cuff, typically no atherosclerotic plaques are observed.
 
In conclusion, the shear stress-modifying cuff procedure is a reliable surgical approach to produce phenotypically different atherosclerotic lesions in ApoE-deficient mice.

The constricting cuff presented in this article is designed to induce atherosclerosis in the murine common carotid artery. Due to the conical shape of its inner lumen the implanted cuff generates well-defined regions of low, high and oscillatory shear stress triggering the development of atherosclerotic lesions of different inflammatory phenotypes.

Impianto di un bracciale carotidea per innescare Shear-stress aterosclerosi indotta in topi

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Topo adulto venosa Ipertensione Modello: carotide comune di External Vena giugulare anastomosi.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell&#39;arteria cerebrale media distale

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cateterismo dell&#39;arteria carotide e giugulare Vena di eseguire misure emodinamiche, Infusi e campionamento del sangue in un modello di ratto cosciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and cellular mechanisms involved in vascular smooth muscle dedifferentiation, neointima formation and vascular remodeling. Male Sprague-Dawley rats are the most frequently employed animals for this model. Female rats are not preferred as female hormones are protective against vascular diseases and thus introduce a variation into this procedure. The left carotid is typically injured with the right carotid serving as a negative control. Left carotid injury is caused by the inflated balloon that denudes the endothelium and distends the vessel wall. Following injury, potential therapeutic strategies such as the use of pharmacological compounds and either gene or shRNA transfer can be evaluated. Typically for gene or shRNA transfer, the injured section of the vessel lumen is locally transduced for 30 min with viral particles encoding either a protein or shRNA for delivery and expression in the injured vessel wall. Neointimal thickening representing proliferative vascular smooth muscle cells usually peaks at 2 weeks after injury. Vessels are mostly harvested at this time point for cellular and molecular analysis of cell signaling pathways as well as gene and protein expression. Vessels can also be harvested at earlier time points to determine the onset of expression and/or activation of a specific protein or pathway, depending on the experimental aims intended. Vessels can be characterized and evaluated using histological staining, immunohistochemistry, protein/mRNA assays, and activity assays. The intact right carotid artery from the same animal is an ideal internal control. Injury-induced changes in molecular and cellular parameters can be evaluated by comparing the injured artery to the internal right control artery. Likewise, therapeutic modalities can be evaluated by comparing the injured and treated artery to the control injured only artery.

This protocol uses a balloon catheter to cause an intraluminal injury on the rat carotid artery and henceforth elicit neointimal hyperplasia. This is a well-established model for studying the mechanisms of vascular remodeling in response to injury. It is also widely used to determine the validity of potential therapeutic approaches.

Vascolare Balloon Lesioni e intraluminale Amministrazione in Rat carotide

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Cloruro ferrico-indotta Trombosi modello murino sulla carotide e Mesentere Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...