La terapia individualizzata per i pazienti con fibrosi cistica può essere ottenuta da un modello di malattia in vitro per comprendere l'attività cftr al basale. Gli organoidi epiteliali nasali umani, o organoidi HNE, producono lumen di varie dimensioni che si correlano con l'attività CFTR, distinguendo tra organoidi CF e non CF. Qui, abbiamo descritto in dettaglio una metodologia per la coltivazione e l'imaging di questi organoidi HNE.
Il trasporto ionico epiteliale disfunzionale, in particolare quello del cloruro e del bicarbonato, si traduce in una diminuzione del volume dei fluidi di rivestimento epiteliale. Ciò influisce anche sulle secrezioni di muco che portano a mucostasi e ostruzione. Pertanto, il nostro modello HNE è stato sviluppato per varie applicazioni, a seconda del design sperimentale e delle risorse dello sperimentatore.
Oltre a valutare l'attività della CFTR al basale o in risposta alle terapie, questa tecnica può essere applicata anche ad altre malattie che coinvolgono la funzione delle cellule epiteliali, in particolare il trasporto di fluido cellulare epiteliale. Questi metodi sono stati sviluppati principalmente per l'uso negli studi sulla fibrosi cistica. Altri studi che valutano gli epiteli delle vie aeree, come la discinesia ciliare primaria, possono anche trovare utili questi metodi.
Queste tecniche richiedono attenzione ai dettagli e precisione. Richiedono anche un'attenta osservazione per garantire che l'espansione iniziale delle cellule sia appropriata. Monitora tutte le culture ogni giorno e il successo sarà più probabile.
Per iniziare, dissociare la biopsia del pennello nasale in 8 milliters di mezzi RPMI in un tubo conico da 15 millilitri facendo passare il pennello citologico più volte attraverso una punta di pipetta di un millilitro di grande diametro. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e quindi sospendere nuovamente il pellet cellulare in tre millilitri di soluzione di distacco cellulare.
Incubare a temperatura ambiente per 16 minuti per digerire. Utilizzare cinque millilitri del mezzo di espansione per lavare le celle due volte. Quindi, aggiungili a un pallone T75, pre-seminato con fibroblasti 3T3 irradiati, inattivati e dal 50 al 60% confluenti.
Consentire alle cellule di co-coltivare ed espandersi nel mezzo di espansione per 7-14 giorni. Se gli antibiotici sono stati introdotti per le cellule derivate da pazienti con fibrosi cistica, i mezzi devono essere sostituiti con mezzi di espansione privi di antibiotici dopo i primi tre giorni di coltura e possono continuare a cambiare i mezzi ogni due giorni fino all'80% di confluenti. Lavare le celle con 1x DPBS.
Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di 0,05% di tripsina-EDTA nel pallone T75 e incubare per quattro minuti a 37 gradi Celsius per rimuovere il fibroblasto 3T3 irradiato e inattivato dalla coltura. Risciacquare il pallone T75 con 1x DPBS due volte per lavare accuratamente via eventuali fibroblasti 3T3 rimanenti. Aggiungere 1,5 millilitri di 0,05% di tripsina-EDTA nel matraccio T75 e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius per staccare gli HNE.
Neutralizzare la tripsina con inibitore della tripsina di soia in un rapporto uno-a-uno. Centrifugare le cellule a 500 volte gi per cinque minuti. Quindi, scartare il surnatante e lavare le cellule con cinque millilitri di mezzi di espansione una volta.
Le cellule sono ora pronte per la semina per far crescere gli organoidi. Scongelare la matrice extracellulare della coltura organoide o ECM durante la notte a quattro gradi Celsius. Raffreddare le diapositive di angiogenesi a 15 pozzetti durante la notte alla stessa temperatura.
Quindi, raffreddare le punte della pipetta a quattro gradi Celsius. Rivestire i vetrini con cinque microlitri di freddo 100% ECM su ghiaccio. Metterli in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti per il consolidamento.
Contare gli HNE raccolti dalla co-coltura usando un emocitometro. Quindi, diluire le cellule a 500 cellule per microlitri in numero totale, con il 20% di ECM diluito dai mezzi di differenziazione sul ghiaccio. Estrarre i vetrini rivestiti in ECM dall'incubatore e seminare cinque microlitri della miscela ECM a celle fredde in ciascuno dei pozzetti.
Trasferire immediatamente i vetrini in un incubatore di coltura a 37 gradi Celsius per un'ora per consolidare la miscela ECM cellulare. Successivamente, estrarre i vetrini dall'incubatore e alimentare le cellule in ciascun pozzetto dei vetrini di angiogenesi a 15 pozzetti con 50 microlitri del mezzo di differenziazione. Restituire la diapositiva nell'incubatore di colture a 37 gradi Celsius, cambiando il supporto a giorni alterni fino a quando gli organoidi sono pronti per ulteriori esperimenti.
Pre-trattare le diapositive della camera con fondo di vetro a 8 pozzetti con adesivo cellulare per 30 minuti. Scartare la soluzione e asciugare all'aria i pozzetti per altri 30 minuti. Quindi, scartare il supporto dalla parte superiore dell'ECM e quindi aggiungere 50 microlitri del PBS 1x freddo in ciascun pozzetto delle diapositive a 15 pozzetti sul ghiaccio.
Pipetta su e giù da tre a cinque volte utilizzando 200 microlitri della punta della pipetta di grande diametro. Erogare la soluzione al centro di un pozzo delle diapositive a camera a 8 pozzetti. Rimuovere immediatamente il liquido in eccesso dai pozzetti con una pipetta a punta fine.
Quindi, posizionare lo scorrimento della camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per 40 minuti per migliorare l'organoide aderente al fondo di vetro. Dopo 40 minuti, lavare delicatamente gli organoidi con 1x PBS due volte e fissarli con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto per 30 minuti impostare la temperatura ambiente. Lavare due volte con 1x PBS e conservare gli organoidi in 1x PBS impostare quattro gradi Celsius per immunocolorare per un massimo di due settimane.
Per raccogliere gli organoidi per gli studi istologici, rimuovere il supporto dalla coltura e aggiungere 50 microlitri di freddo uno 1x PBS in ogni pozzetto dei vetrini sul ghiaccio. Pipetta su e giù da tre a cinque volte utilizzando una punta della pipetta a foro grande da 200 microlitri. Combina tutte le soluzioni degli inserti di scorrimento o coltura a 15 pozzetti in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio.
Regolare il volume totale della soluzione nel tubo a 10 millilitri aggiungendo 1 PBS freddo. Centrifugare il tubo a quattro gradi Celsius, 300 volte g per cinque minuti. Quindi, aspirare il surnatante e aggiungere 60 microlitri di histogel caldo da mescolare con il pellet organoide usando una punta di pipetta di grande diametro da 200 microlitri.
Trasferire immediatamente la sospensione in uno stampo istologico. Dopo aver consolidato l'istogel a temperatura ambiente, mettere il blocco dello stampo in paraformaldeide al 4% per la fissazione durante la notte a quattro gradi Celsius. Apri il software e fai clic con il pulsante destro del mouse nella parte inferiore dello schermo.
Quindi, selezionare Controlli di analisi, quindi Risultati misurazione automatizzati. Aprire l'immagine organoide e selezionare da 5 a 10 organoidi con lumen visibili. Tenere premuto il tasto destro del mouse sull'immagine per aprire il menu e selezionare ROI poligonale per delineare l'organoide completo per ottenere la superficie totale dell'organoide.
Quindi, delineare il lumen per ottenere l'area del lumen. Ripeti questo per gli organoidi rimanenti nel pozzo e tutti i pozzetti nel test. Infine, esporta i dati in Excel.
Dividere l'area del lumen per la superficie totale e calcolare la media di tutti gli organoidi del campione per ottenere il baseline lumen Ratio. Le immagini di campo luminose rappresentano gli HNE di una raccolta di campioni riuscita e non riuscita. Gli HNE crescono bene in un grande cluster.
Al contrario, gli HNE crescono male in due piccoli cluster che circondano le cellule 3T3 irradiate. Gli organoidi nella diapositiva a 15 pozzetti hanno immagini più precise e nitide di quelle nell'inserto della coltura. Oltre a questo, non è stata osservata alcuna differenza morfologica significativa in questi due metodi di coltura.
Gli organoidi non CF hanno in genere un lume più grande e più fluido rispetto agli organoidi CF. La colorazione HNE negli organoidi di un soggetto non-CF, F508del/F508del, e la colorazione immunofluorescente delle ciglia in un organoide sono mostrate in queste immagini. Le ciglia colorate con tubulina acetilata, anticorpo secondario marcato FITC e i nuclei etichettati con DAPI sono mostrati qui.
Le immagini di proiezione massima dei due organoidi rappresentativi mediante colorazione immunofluorescente a montaggio intero e le corrispondenti immagini di ricostruzione tridimensionale sono mostrate qui. Vengono mostrati muco e ciglia all'interno del lume degli organoidi. Le immagini grafiche rappresentano il test del gonfiore indotto da forskolina per testare la funzione CFTR sulle cellule epiteliali nasali primarie.
Un esperimento rappresentativo di forskolina dose-risposta di volontari non CF è mostrato qui. La dose-risposta FSK viene confrontata con la variazione frazionaria media a un'ora, rispetto a otto ore, il che suggerisce che il test di otto ore può produrre una differenza di gonfiore più significativa tra diverse dosi di FSK rispetto a quelle a un'ora. L'area sotto la curva può mostrare una piccola differenza di gonfiore rispetto alla variazione frazionaria media a otto ore.
Durante il tentativo di questa procedura, tieni presente che gli organoidi andranno persi durante il processo di raccolta, fissazione e colorazione. Quindi, è necessario prestare molta attenzione durante ogni fase e ottenere numeri di partenza sufficienti per garantire il successo. La crescita di organoidi in inserti di coltura può aiutare in questo senso, poiché queste tecniche sono sviluppate.
Qui, abbiamo utilizzato reagenti e forniture disponibili in commercio per facilitare l'espansione ad altri investigatori. È stato inoltre sviluppato un test funzionale che utilizzava tecniche di microscopio comuni e attrezzature più specializzate.
