I preadipociti primari sono un prezioso sistema sperimentale per comprendere le vie molecolari che controllano il metabolismo degli adipociti. Gli embrioni di pollo offrono l'opportunità di isolare i preadipociti fin dalla prima fase dello sviluppo degli adipociti. Questo metodo è stato ottimizzato per produrre cellule con elevata vitalità e maggiore capacità di differenziarsi in adipociti maturi, che possono essere utilizzati per l'analisi funzionale della crescita del grasso precoce e dello sviluppo embrionale nei pulcini.
Il processo di differenziazione adipogenica è altamente comparabile tra polli e umani. Pertanto, i preadipociti isolati possono essere utilizzati come modello a doppia proposta per studi rilevanti per l'uomo e il pollame. Per iniziare il tampone il corpo dell'embrione con il 70% di etanolo.
Quindi, per evitare interferenze durante la filtrazione nelle fasi successive dopo la digestione, strofinare delicatamente la superficie della pelle con una garza sterile per rimuovere le piume. Quindi tagliare la pelle tra le gambe e la regione addominale per rivelare la coppia di depositi adiposi femorali. Utilizzare una pinza curva con una mano per tenere la pelle intorno alla gamba e rimuovere delicatamente il grasso sottocutaneo femorale.
con l'altra mano. Successivamente, utilizzare una pinza curva per allontanare delicatamente il deposito dalla gamba. Trasferire i tessuti in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzi di raccolta e ripetere la dissezione per l'altro lato del cuscinetto di grasso.
Ora, trasferire i cuscinetti di grasso raccolti in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente soluzione di sterilizzazione e risciacquare brevemente facendo roteare il piatto un paio di volte. Quindi risciacquare la soluzione di sterilizzazione trasferendo i cuscinetti di grasso in una capsula di Petri da 60 millimetri contenente PBS. Ruotare delicatamente la piastra e, ancora una volta, lavare con PBS.
Per la digestione dei tessuti adiposi, trasferirli in un tubo da 15 millimetri contenente soluzione enzimatica preriscaldata. Quindi immergere un paio di lunghe forbici dritte nel tubo e infine tritare i tessuti adiposi nella soluzione in pezzi il più piccoli possibile. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione enzimatica in un matraccio autoclavato da 25 millilitri.
Avvolgere il pallone con pellicola di paraffina e posizionare il matraccio in un incubatore shaker orbitale a 37 gradi Celsius per la digestione. Dopo la digestione, pipettare delicatamente su e giù per mescolare bene. Quindi rimuovere eventuali frammenti di tessuto e detriti non digeriti filtrando attraverso un filtro di tessuto da 250 micrometri in un tubo da 15 millilitri mediante pipettaggio.
Ora, rimuovere le cellule aderenti al pallone risciacquando il pallone con quattro millilitri di terreno di crescita e filtrare la sospensione cellulare nello stesso tubo da 15 millilitri. Quindi risciacquare il colino pipettando nuovamente il mezzo di crescita per rimuovere eventuali cellule intrappolate nel filtro. Centrifugare a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente per pellettizzare la frazione cellulare e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare.
Risospendare delicatamente il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi, mescolare bene mediante pipettaggio e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi diluire le cellule aggiungendo cinque millilitri di mezzi di crescita al tubo contenente le cellule e mescolarle delicatamente mediante pipettaggio. Ora, pipettare le celle su un filtro cellulare da 40 micrometri e filtrarle in un nuovo tubo da 50 millilitri.
Quindi risciacquare il filtro con altri cinque millilitri di mezzi di crescita e pellettizzare le celle centrifugando a 300 volte G per sette minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante. Risospesso il pellet cellulare rimanente in un millilitro di terreno di crescita mediante pipettaggio Per determinare la densità e la vitalità della cella, mescolare 10 microlitri di ciascun campione in tripano blu mediante pipettaggio.
Caricare 10 microlitri della miscela sull'emocitometro e contare le celle. L'analisi dei preadipociti dopo 24, 48 e 72 ore ha mostrato una morfologia e un numero cellulari normali. L'induzione adipogenica dei preadipociti ha mostrato una rapida differenziazione e accumulo di goccioline lipidiche.
La manipolazione aggressiva dei preadipociti durante l'isolamento ha provocato danni cellulari e un basso numero di cellule. La contaminazione microbica può essere osservata nonostante l'adozione di misure preventive. La colorazione lipidica con olio rosso O ha indicato che i preadipociti iniziano rapidamente a sviluppare goccioline lipidiche sotto induzione adipogenica e l'accumulo progredisce nel tempo come osservato in 24, 48 e 72 ore.
L'accumulo lipidico relativo al numero di cellule è stato quantificato utilizzando macchie lipidiche e di DNA. Sia l'accumulo lipidico che la proliferazione cellulare sono aumentati nel tempo. Un basso numero di cellule o cellule danneggiate possono essere osservate quando le frazioni tissutali vengono digerite troppo a lungo.
Pertanto, si raccomanda di non superare un'ora e mezza di digestione. I preadipociti isolati possono essere utilizzati per studi di espressione genica. È possibile ottenere un RNA sufficiente per l'uso nella sintesi del cDNA e nel follow-on qPCR o RNAseq.
