We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).

Questo protocollo richiede l&#39;utilizzo di vivo, zebrafish adulto per la produzione di embrioni. Gli embrioni vengono raccolti per la raccolta dei tessuti. E &#39;essenziale per ottenere l&#39;approvazione da etici appropriati revisione schede per condurre questo esperimento. 1. Ottenere embrioni graduali <ol><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, preparare sano, zebrafish adulti per la riproduzione. Inserire un maschio e una femmina su lati opposti di una netta barriera in un serbatoio di allevamento. </li><li> Ripetere 1.1 a molti vasche di allevamento come necessari per la produzione di embrioni sufficiente per l&#39;applicazione a valle. Ottenere embrioni da entrambi i pesci wild type e pesci transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti nel tipo cellulare di interesse. NOTA: Il numero di embrioni necessari per applicazioni a valle Fasi 2-8 dipende dalla abbondanza relativa delle cellule di interesse per il punto temporale di interesse. Anche se questo può variare a seconda del tipo di cellula, 200 embrioni producono 2,000-5,000 cellule ordinati quando la cbraccia di interesse rappresentano &lt;1,0% delle cellule totali a 24 HPF (ore dopo la fecondazione). </li><li> La mattina successiva, cambiare l&#39;acqua nel serbatoio panatura trasferendo pesce a un serbatoio di allevamento fresco e rimuovere il divisore. Inclinare il serbatoio con un angolo per incoraggiare l&#39;allevamento. </li><li> Raccogliere gli embrioni in scena. <ol><li> Ogni 15 minuti, raccogliere gli embrioni trasferendo gli adulti ad un serbatoio di allevamento fresco e passando le uova, che sono lasciati alle spalle attraverso un colino da tè. NOTA: zebrafish embrioni si sviluppano in modo sincrono quando mantenuto a densità e temperature paragonabili. </li><li> Lavare le uova con l&#39;uovo d&#39;acqua (0,21 g / L sali Ocean istantanei in acqua distillata doppia 1 L) e trasferimento in una capsula di Petri. Trasferire la capsula di Petri di un incubatore umida a 28,5 ° C con circolazione di aria. </li></ol></li><li> Due ore dopo l&#39;ultima raccolta, ordinamento fecondato, embrioni multicellulari in 10 cm capsule di Petri e ridurre la densità a 50 embrioni per piatto. Selezionare gli embrioni provenienti da una singola, 15finestra temporale min di raccolta per l&#39;applicazione a valle. Incubare gli embrioni a 28,5 ° C. NOTA: Per esempio, raccogliere gli embrioni alle 8:30, 8:45, 9:00, 9:15, 9:30, 09:45, 10:00 e 10:15. Confrontando attraverso punti di tempo, se il maggior numero di embrioni fecondati sono dalle grinfie raccolti alle 9:00, quindi utilizzare solo questi embrioni per applicazioni a valle. </li></ol> 2. Impostare per singola cella Dissociazione <ol><li> Circa 30 minuti prima del punto di tempo di interesse (18 HPF) rimuovere gli embrioni dalla loro corion manualmente con una pinza sottile. </li><li> Raccogliere ed etichettare la seguente per ogni condizione: due 2 ml microprovette, uno di 40 micron colino cella, una 35 millimetri piatto di coltura cellulare, e due tubi FACS sormontato da un colino cella di 35 micron. </li><li> Raffreddare i seguenti reagenti su ghiaccio: Uovo acqua contenente 0.21g / L sali Ocean istantanea in 1L di acqua bidistillata; De-yolking Buffer contenente 55 mM NaCl, KCl 1,8 mm e 1,25 mm NaHCO 3; e FACS tampone contenente del Leibovitz L-15 multimediale integrato con siero fetale bovino al 5% inattivato al calore. </li><li> Portare 1 ml per campione di cellule dissociazione reagente 1 a RT. Scongelare 1 ml cellulare dissociazione reagente 2 per campione sul ghiaccio. Portare a Rt immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. La dissociazione Single Cell <ol><li> Usando una pipetta di vetro un&#39;ampia foro, trasferire 100-300 embrioni in una provetta da 2 ml microcentrifuga in un volume minimo di acqua Egg. </li><li> Euthanize embrioni sostituendo l&#39;acqua con 1 ml ghiacciata Egg Acqua e sommergendo tubo in ghiaccio per 20 min. ATTENZIONE! E &#39;fondamentale per ottenere l&#39;approvazione da adeguata comitato di sorveglianza la cura degli animali istituzionale per questo metodo di eutanasia (agghiacciante sul ghiaccio seguito da dissociazione cellulare come l&#39;eutanasia secondaria). l&#39;eutanasia standard in genere richiede che gli embrioni &lt;3 giorni dopo la fecondazione sono sbiancati dopo che sono stati refrigerati, che non è appropriato per l&#39;ottenimento di cellule vitali. </li><li> Lavare gli embrioni due volte con 1 ml ghiacciata Egg acqua. Per lavare, utilizzare una vasta pipetta di vetro foro per rimuovere Uovo acqua e un P1000 per aggiungere Egg acqua. </li><li> Rimuovere il tuorlo sostituendo l&#39;acqua embrione con 1 ml Deyolking tampone e triturazione 8-12 volte con una punta P1000, o fino a quando il tuorlo è sciolto e solo i corpi degli embrioni sono visibili. </li><li> Raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 300 xg per 1 min. Usare una pipetta per rimuovere delicatamente il surnatante senza interrompere il precipitato di tessuto. Risospendere in 1 ml di acqua Egg. </li><li> Ripetere il punto 3.5, per un totale di tre lavaggi, ma il lavaggio finale, risospendere in 1 ml di RT cellulare dissociazione reagente 1. </li><li> Incubare in cella di dissociazione reagente 1 per 10 minuti a temperatura ambiente con tubi in posizione orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente con una pipetta P1000 per evitare grumi. NOTA: Maneggiare campioni delicatamente durante le fasi di triturazione. A volte un unico, grande gruppo si forma nel tubo da un groviglio di corpi embrionali. Questo saràdisperdere con la digestione ulteriore aiutato dalla leggera triturazione. NON FARE VORTEX. </li><li> Raccogliere tessuti mediante centrifugazione a 300 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di cellule dissociazione reagente 2. </li><li> Incubare per 5-15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in orizzontale. Ogni 2-3 minuti, triturare delicatamente per evitare grumi. Ogni 5 min, valutare i progressi compiuti digestione. <ol><li> Per valutare i progressi compiuti digestione, diluire 2 ml surnatante in 18 microlitri FACS tampone e pipetta come una goccia su un piatto di coltura cellulare. </li><li> Mettere un vetrino sul campione ed osservare sotto una cultura al microscopio del tessuto a 10X e 20X ingrandimenti. NOTA: La preparazione dovrebbe apparire come un insieme di celle singole, piccoli gruppi, grandi gruppi, e occasionali corpo dell&#39;embrione per lo più intatto. </li><li> Visivamente valutare la proporzione della preparazione che è singole cellule e piccoli cluster. NOTA: Over-digestione sarà ridurre la vitalità; sotto-digestione ridurrà singolo rendimento delle cellule. &lt;/ Li&gt; </ol></li><li> Raccogliere il preparato cellulare mediante centrifugazione a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 ml freddo FACS tampone. </li><li> Inumidire un colino cella di 40 micron con FACS tampone. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro cella 40 micron su un piatto di coltura cellulare da 35 mm. Lavare il filtro delle cellule una volta con 1 ml FACS ordinamento buffer. </li><li> Trasferire il flusso continuo in una provetta 2 ml. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 300 xg per 5 minuti e risospendere in 100 ml FACS tampone. </li><li> Conte rendimento delle cellule utilizzando un emocitometro. Ulteriori diluire i campioni di 5x10 6 cellule per ml, o la concentrazione ottimale consigliati per FACS macchina di scelta. Opzionale-Quando il conteggio delle cellule rendimento sul emocitometro, le cellule morte di contrasto con trypan blu per confermare la vitalità della preparazione cellulare prima di FACS ordinamento. NOTA: I preparativi che sono troppo diluito avrà eccesso quantità di tempo per ordinare. I preparativi che sono troppo concentrated tendono a raggrupparsi in multimeri e sono ottimali per l&#39;ordinamento di una popolazione pura. </li><li> Riserva il 10-20% di ciascun campione da utilizzare come controlli non colorati. Per i campioni rimanenti, le cellule morte macchia aggiungendo un guasto (L / D) discriminazione / live colorante fluorescente in ciascun campione. Non lavare. NOTA: Qualsiasi colorante fluorescente che penetra cellule con membrane cellulari compromesse e macchie acidi nucleici possono essere utilizzati come colorante L / D, a condizione che gli spettri di fluorescenza è compatibile con la macchina FACS di cellule scelta ed etichettatura fluoroforo di interesse. <ol><li> Non lavare la preparazione dopo aver aggiunto il colorante come alcune cellule moriranno in transito alla purificazione FACS e dovrebbero essere esclusi dalla popolazione ordinata. </li></ol></li><li> Inumidire il filtro 35 micron cella ricoperto tubo FACS con 20 microlitri di buffer FACS. Aggiungere cellule per il filtro e raccogliere per gravità. Conservare su ghiaccio. </li></ol> 4. FACS arricchimento <ol><li> Utilizzare FACS per arricchire per singolo, Cellule vive che esprimono il marcatore fluorescente. <ol><li> Impostare una porta per distinguere le cellule dai detriti su un grafico a dispersione di forward scatter (FSC-A) di ampiezza vs ampiezza lato scatter (SSC-A), entrambi con scala lineare. Attenzione cellule Zebrafish sono in genere più piccolo del mouse o cellule umane. Ciò si riflette in una separazione basale minore tra cellule e detriti. </li><li> Dal cancello impostato in 4.1.1, impostare una porta per arricchire per singole cellule ed escludere multimeri utilizzando un grafico a dispersione di altezza avanti scatter (FSC-H) e bassa altezza laterale scatter (SSC-H), entrambi con scala lineare. NOTA: Celle con sproporzionatamente alta FSC-H e basso SSC-H sono probabili multimeri e sono esclusi dalla selezione. </li><li> Dal set porta al punto 4.1.2, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive usando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l&#39;ampiezza del canale utilizzato per rilevare L / D macchia con scala log. Includere cellule negative L / D. </li><li> Da parte diil cancello situato in 4.1.3, utilizzando i controlli singolo colore, impostare una porta per includere solo le cellule vive con fluorescenza positiva utilizzando un grafico a dispersione di FSA-A con scala lineare e l&#39;ampiezza del canale utilizzato per rilevare marker delle cellule proteina fluorescente con scala di registro . Includi cellule positive. </li><li> Regolare tutti i controlli di compensazione, se necessario, per tenere conto di interferenza tra la L / D macchia e spettri proteina fluorescente. </li></ol></li><li> logica sorta Set per le cellule che rientrano in tutte le porte impostati nella fase 4.1. <ol><li> Utilizzando cellule doppio etichettati, verificare gating per l&#39;ordinamento delle cellule. NOTA: Le cellule per l&#39;ordinamento sarà cellule piuttosto che detriti, singole cellule piuttosto che multimeri, L / D cellule positive negative e fluorescenza. </li></ol></li><li> Ordina 2000-4000 cellule dalla popolazione di interesse in 5 ml di freddo FACS tampone in una provetta su ghiaccio. Per minimizzare tranciatura e deformazione su cellule di cernita, utilizzare le pressioni più basse possibili per la cellasorter. NOTA: La gocciolina 5 microlitri di tampone FACS funge da ammortizzatore per le cellule in uscita della macchina FACS. Raccolta 2000-4000 cellule direttamente nel FACS Buffer elimina la necessità di centrifugazione prima di caricare sui chip IFC. Questa strategia è raccomandato perché centrifugazione può portare alla formazione di multimeri se le cellule aderiscono l&#39;uno all&#39;altro nel pellet. </li><li> Valutare la fattibilità analisi post-specie. <ol><li> Trasferire 1 ml cellule ordinati ad un tubo FACS fresco con 100 ml FACS ordinamento tampone e 1: 1000 diluizione L / D macchia. Far passare le cellule attraverso il sorter FACS con la strategia di gating al punto 4.1. Utilizzare la proporzione di L / D negativo a positivo stimare vitalità delle cellule ordinati. </li></ol></li></ol> 5. Le cellule caricare sul microfluidica Chip <ol><li> Utilizzando un emocitometro, misurare sia la concentrazione e la dimensione delle cellule ordinati. <ol><li> Diluire le cellule ordinati ad almeno 10 ml. Diluire un&#39;aliquota del 5 μ; Celle l con 5 ml trypan blu. Caricare sul emocitometro e applicare vetrino. </li><li> Raccogliere le immagini in campo chiaro di tutte le cellule in 4 x 4 griglie di emocitometro. Contare il numero di cellule vive e calcolare vivi cellule / ml. cellule vive non occupano trypan blu. NOTA: utilizzare qualsiasi software di analisi delle immagini standard per misurare il diametro di tutte le cellule vive. Calcolare la deviazione media e standard della dimensione della cella, e selezionare una piastra IFC adatto al calibro cella di interesse. Se gamma dimensione della cella si trova a cavallo di dimensione celle piatto IFC, utilizzare più piatti per catturare l&#39;intera gamma di cellule di interesse. </li></ol></li><li> Le celle di carico su di IFC piatto secondo le istruzioni del produttore (vedi Materiali). <ol><li> Diluire le cellule a 1x10 6 cellule / ml e di eseguire l&#39;ottimizzazione dell&#39;assetto secondo le istruzioni del produttore. NOTA: ottimizzazione galleggiabilità assicura che le cellule non si depositano sul fondo né a galla della WEL caricol per il carico ottimale su chip di IFC. Il rapporto di tampone di cellule può variare secondo il tipo cellulare, ma varia tipicamente 6: 4-7: 3 di celle: buffer. </li><li> Aggiungere cellule per piastra-IFC innescato. Piatto di carico in macchina fluidica compatibile, ed eseguire uno script di carico delle cellule di spingere le cellule attraverso il circuito microfluidica e in corsie di cattura. </li></ol></li><li> Verificare che le cellule sono alloggiati in siti di cattura sulla piastra IFC. <ol><li> Rimuovere IFC piatto dalla macchina fluidica. Montare la piastra di IFC su un microscopio dotato di una piastra di adattamento. </li><li> Raccogliere istantanee di campo chiaro e fluorescenza per ogni sito di cattura a 10X di ingrandimento. NOTA: Campo chiaro volte di acquisizione possono variare da 10-50 ms, a seconda della intensità della lampada. i tempi di acquisizione fluorescenza possono variare da 250-750 ms, a seconda della luminosità fluoroforo. Evitare di sovraesposizione cellule per prevenire fotodanneggiamento. </li></ol></li></ol> 6. cDNA Synthesis <ol><li> Eseguire lisi cellulare in situ in base al Ile istruzioni del produttore piatto FC. <ol><li> Aggiungere i buffer di lisi ai pozzetti sulla piastra IFC. Piatto di carico sulla fluidica compatibili macchina e lo script lisi cellulare corsa secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Eseguire la trascrizione inversa in base alle istruzioni del produttore piatto IFC. <ol><li> Aggiungere i reagenti trascrizione inversa alla piastra di IFC. Piatto di carico sulla macchina fluidica compatibili. Eseguire lo script trascrizione inversa. Esempi di condizioni di ciclo: 1 ciclo a 25 ° C per 10 min, 1 ciclo a 42 ° C per 1 ora, poi 1 ciclo a 85 ° C per 5 min. </li></ol></li><li> Eseguire pre-amplificazione con sonde gene-specifici in base alle istruzioni del produttore piatto IFC. NOTA: A causa della loro maggiore specificità con i numeri a basso copiare, utilizzare sonde fluorogeniche marcato piuttosto che le sonde ottimizzati per l&#39;uso con coloranti intercalanti. <ol><li> primer Pool e diluire a finale 180 nm ciascuno. Aggiungere primer in pool al piatto IFC. Piatto di carico su fluidi compatibilimacchina cs. script di preamplificazione Esegui. </li></ol></li><li> Eseguire pre-amplificazione con le seguenti condizioni di ciclo: 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, quindi 18 cicli con denaturazione a 95 ° C per 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 4 min. Conservare pre-amplificato cDNA a 4 ° C fino alla raccolta. Harvest cDNA dalla piastra microfluidica in base alle istruzioni del produttore e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 7. Selezionare cDNA da singole cellule per singolo obiettivo qRT-PCR <ol><li> Diluire cDNA in 25 reagente di diluizione ml in base alle istruzioni del produttore. NOTA: resa finale è di circa 28 ml di cDNA pre-amplificata per cella. Prenotare una aliquota di diluente per uso come controllo non-template in qRT-PCR. <ol><li> Riferendosi al campo chiaro e le immagini fluorescenti registrate nella fase 5.3.2, segnare ogni sito di cattura. contare manualmente e registrare il numero di cellule. Valutare e registrare se ogni cella è l&#39;influenzaorescent. NOTA: Ogni singolo sito può contenere 0, 1, o&gt; 1 cella, dove&gt; 1 cella include siti di cattura che contengono più celle e / o detriti non identificabile. Se le immagini sono qualità sufficiente, un valore di pixel può anche essere assegnata per quantificare l&#39;intensità del segnale di fluorescenza. </li></ol></li><li> Selezionare i campioni per l&#39;analisi qRT-PCR. <ol><li> Selezionare campioni di cDNA da siti di cattura identificati nella fase 7.2 che contengono esattamente 1 cella con fluorescenza positiva. Pool 1 ml aliquote di cDNA da ciascun campione. NOTA: Questo è il controllo positivo &quot;Pool&quot; utilizzato per determinare se i geni di interesse sono espressi in una qualsiasi delle celle selezionate. </li><li> Selezionare cDNA da almeno un sito di cattura che contiene esattamente 0 cellule come controllo negativo. Utilizzare diluente dal punto 7.1.2 come un controllo non-modello. </li></ol></li><li> Eseguire test di qRT-PCR. <ol><li> Utilizzare solo sonde utilizzate per la pre-amplificazione in fase 6.4.1. Caricare tutti i campioni in triplicate. condizioni bicicletta per una reazione di 10 microlitri su 384 pozzetti: 1 ciclo a 50 ° C 2 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, 40 cicli con denaturazione a 95 ° C 15 sec poi ricottura ed estensione a 60 ° C per 1 min. </li></ol></li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> Convalida qRT-PCR prodotti mediante elettroforesi su gel standard. Confermare prodotto è una singola banda a peso molecolare atteso (varia per ogni sonda). NOTA: Se una sonda produce più bande o una singola banda in una dimensione inadeguato, allora la specificità è discutibile, e questo esclude il gene dall&#39;analisi. </li><li> Esaminare tutte le curve di amplificazione e tenere conto di eventuali anomalie 14. Calcolare il valore medio CT per ogni combinazione campione / gene 15. NOTA: valori CT per i controlli positivi in ​​genere varia 10-30. valori CT per i controlli negativi in ​​genere varia 35-40 (senza amplificazione). valori CT 30-35 sono considerati molto bassa espressionee dovrebbero essere interpretati con cautela 14. </li><li> I dati del rapporto <ol><li> Se i campioni cadono nel CT = 10-30, i dati possono essere segnalati anche come cambiamento volte trascrizione abbondanza relativa ad un campione di controllo. NOTA: Fold cambiamento è uguale a 2 ^ (- ΔΔCT) dove ΔCT è relativa a un gene housekeeping sottraendo la media CT del campione del gene housekeeping e ΔΔCT è le differenze di ΔCT tra il campione e un controllo positivo 15. </li></ol></li></ol>

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<li>Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+reference+genes+for+quantitative+real-time+RT-PCR+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biochimica+et+biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization.</a> Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).</li>
<li>Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+in+the+heart+field+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation in the heart field of zebrafish.</a> Development. 125, 1095-1101 (1998).</li>
<li>de Pater, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+phases+of+cardiomyocyte+differentiation+regulate+growth+of+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart.</a> Development. 136, 1633-1641 (2009).</li>
<li>Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cardiac+development+requires+a+conserved+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field.</a> Development. 138, 2389-2398 (2011).</li>
<li>Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+expression+of+cardiac+myosin+genes+reveals+regulated+aspects+of+heart+tube+assembly+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish.</a> Developmental biology. 214, 23-37 (1999).</li>
<li>Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

Il metodo qui descritto utilizza espressione di una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico tipo cellulare per arricchire una popolazione di cellule progenitrici cardiache da embrioni di zebrafish per l&#39;uso nel sistema di assistita acquisizione singola cella microfluidica per valutare l&#39;espressione di un sottogruppo di geni cardiaci nei singola cellule. A condizione che le capacità FACS eccitazione laser e di emissione sono compatibili con il fluoroforo (s) di scelta, questo metodo pu...

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l&#39;esito della malattia. Comprendere l&#39;espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti 1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che rende difficile per rilevare sottili cambiamenti nell&#39;espressione genica che in ultima analisi iniziativa per le decisioni sul destino delle cellule 3. Analogamente, un singolo tipo di cellula può avere diversi profili di espressione in risposta al microambiente 4. Ad esempio, le cellule endoteliali residenti nello stesso organo o in diversi organi (ad es., Dell&#39;aorta o renali) mostrano una significativa eterogeneità, nonostante la condivisione di MORP comunehological e funzionale dispone di 5. Inoltre, le cellule tumorali che popolano lo stesso tumore può anche avere diversi profili molecolari o mutazioni a livello di singola cellula 6. In sistemi modello, trascrittomica in singole cellule ha identificato con successo nuove popolazioni di cellule, caratterizzato stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare, e ha rivelato le risposte cellulari differenziali agli stimoli 7,8,9. Tali intuizioni sarebbero stati mascherati in studi basati sulla popolazione convenzionali. embrioni di zebrafish sono una fonte immensamente utilizzato sotto-dello stelo, progenitore, e differenziazione delle cellule per esplorare questioni di singola eterogeneità cellulare e regolazione molecolare delle identità cellulari durante lo sviluppo. Il loro altamente stereotipato, ex vivo lo sviluppo e la facilità di manipolazione genetica loro un sistema modello eccellente per questo approccio 10,11 fanno. In particolare, una limitazione importante per l&#39;interpretazione della singola cellula gendati e espressione è che l&#39;identificazione affidabile di nuovi stati di cella intermedi durante lo sviluppo richiede molto attenti tempi di raccolta dei tessuti 9. Ciò è necessario per garantire che eterogeneità tra cellule catturate rappresenta eterogeneità all&#39;interno di un tessuto in un singolo punto tempo piuttosto che eterogeneità nell&#39;espressione genica presentata dalla differenziazione cellulare dipendente dall&#39;età. Rispetto ai topi, sviluppo embrionale zebrafish può essere sincronizzato con precisione su un ampio numero di embrioni 12. Inoltre, con le grandi dimensioni della covata, embrioni di zebrafish può essere utilizzato come una fonte abbondante di cellule staminali e progenitrici. Questo protocollo descrive un metodo per isolare le cellule da embrioni zebrafish e catturare singole cellule utilizzando un chip e autoprep sistema disponibile commercialmente circuito microfluidica integrato (CFI) per qRT-PCR analisi di espressione genica. Questo protocollo può essere rapidamente trasferibili a qualsiasi test di throughput elevato di multiplazione tra cui interotrascrittoma sequenziamento che permette l&#39;analisi più completa della eterogeneità cellulare 13. Inoltre, offre diversi vantaggi per analisi di espressione genica tradizionali. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule produce alta la vitalità dopo FACS, che diminuisce la proporzione di cellule compromesse che sono inclusi in applicazioni a valle. Utilizzando un IFC, le cellule catturate possono essere osservati direttamente per valutare i tassi di cattura e di valutare la salute delle cellule morfologicamente. Inoltre, questo protocollo è ampiamente applicabile per la comunità di ricerca zebrafish, che richiede solo una linea di pesce transgenico etichettati e l&#39;accesso alle tecnologie di cattura microfluidica cellulare. Come prova di principio, singole cellule derivate da progenitori cardiaci sono stati isolati e catturato su un chip IFC, e quindi la relativa abbondanza di marcatori di differenziazione cardiaci stata misurata qRT-PCR. analisi di espressione genica a livello di singola cellula dimostra che i progenitori cardiaci convivono con la loro differeprogenie ntiating. La conoscenza acquisita da profilatura cella singola di progenitori cardiaci può far luce su l&#39;eterogeneità nei modelli di espressione genica tra cellule progenitrici cardiache durante lo sviluppo dei vertebrati, che potrebbe essere stato mascherato nelle analisi tradizionali basati sulla popolazione.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>For removing the chorion from embryos</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 um cell strainer</td><td>Biobasic</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes topped with 35 um cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20 and tips</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFC chip manufacturer&#039;s protocol</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>Version 100-6117 E1 was used in representative experiment</td></tr><tr><td>Wide bore pastuer glass pippette</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>For transferring embryos</td></tr><tr><td>Adult wild type zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used AB line</td></tr><tr><td>Adult transgenic zebrafish</td><td>N/A</td><td></td><td>We used Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for cell dissociation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double distilled water</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>make stock in water and use for de-yolking buffer</td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>Heat inactivate; any brand of FBS should be fine</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Cell Dissociation Reagent 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use</td></tr><tr><td>pronase (optional)</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D Dye - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for IFC plate use and qRT-PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific probes</td><td></td><td></td><td>Probes will vary by experiment</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Reagents listed in IFC manufacturer&#039;s protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Reagent Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>Reagents for loading cells onto IFC plate</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CT&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps</td></tr><tr><td>Molecular Biology Quality Water</td><td>Corning</td><td>46-000CM</td><td></td></tr><tr><td>C1 IFC for PreAmp (5-10 um)</td><td>Fluidigm</td><td>100-5757</td><td>IFC plate for small cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep machine</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>For IFC plate use</td></tr><tr><td>Hemocytometer&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>For counting cells and assessing cell size</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>For removing embryos from chorion</td></tr><tr><td>Tissue culture microscope</td><td></td><td></td><td>For assessing single cell digestion</td></tr><tr><td>FACS machine</td><td></td><td></td><td>For isolating cells of interest</td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of single cells from zebrafish embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

Come prova di principio, l&#39;espressione del gene è stata valutata per esplorare le dinamiche di differenziazione durante lo sviluppo cardiaco. In zebrafish, i progenitori cardiaci derivano da una popolazione mesoderma di cellule che migrano verso il mesoderma piastra laterale anteriore dove si fondono per formare il tubo cuore lineare. Prima della fusione, i progenitori cardiaci iniziare ad esprimere il fattore di trascrizione Nkx2.5 (NK2 homeobox 5), che è pensato per esse...

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.6K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells. 

Video: Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Ricerca

Neuroscienze

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Genetica

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Biologia dello sviluppo

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparazione di espianti di somite singolo da embrioni di zebrafish

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

Preparazione di espianti di somite singolo da embrioni di zebrafish

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

Elaborazione di cellule intestinali da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autore in primo piano: Isolamento e analisi delle cellule intestinali delle larve di zebrafish per lo studio degli aspetti trascrittomici dello sviluppo gastrointestinale 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Riepilogo

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Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish

Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Preparazione di espianti di somite singolo da embrioni di zebrafish

Preparazione di espianti di somite singolo da embrioni di zebrafish

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula