Questo protocollo fornisce un utile modello cellulare per studiare la funzione e la permeabilità di barriere vascolari selettive come la barriera emato-retinica o emato-encefalica con un focus specifico sulla transcitosi endoteliale. Questo test è facile da configurare e utilizzare e non richiede animali vivi. Può essere utilizzato per studiare vari regolatori molecolari della permeabilità delle cellule endoteliali e della transcitosi che influenzano l'integrità della barriera emato-retinica interna.
Questo test può fornire approfondimenti sulla biologia vascolare e sulla ricerca oculare e cerebrale, consentendo una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base del controllo BRB BBB ed esplorando la potenziale somministrazione di farmaci attraverso le barriere. Per iniziare, preparare gli inserti filtranti per la coltura cellulare per la semina di cellule endoteliali microvascolari retiniche umane o HRMEC, rivestendo ogni inserto con 200 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% per 30 minuti sotto una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie inferiore dell'inserto filtrante.
Prendi una capsula di Petri con HRMEC coltivati incubati a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e aspira il terreno di crescita. Risciacquare delicatamente le cellule due volte con 10 millilitri di 1X PBS sotto la cappa a flusso laminare per eliminare le potenziali cellule galleggianti o morte. Dissociare le cellule con 0,5-1 millilitro di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e posizionare la capsula di Petri nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 5 minuti.
Estinguere l'attività della tripsina aggiungendo da 4,5 a 9 millilitri di terreno di crescita e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri utilizzando una pipetta da 10 millilitri. Girare le cellule a 200 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 3 millilitri di terreno di crescita.
Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro manuale o un contatore di cellule automatizzato e seminare a una densità di 40.000 cellule per inserto del filtro. Il volume della sospensione cellulare per ciascun inserto è di 250 microlitri. Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti contenenti inserti permeabili e trasferire 250 microlitri della sospensione cellulare per inserto, quindi aggiungere solo il mezzo a uno degli inserti, che verrà utilizzato come controllo in bianco per la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale o TEER.
Contemporaneamente, aggiungere anche 750 microlitri di mezzo per pozzetto nelle camere basolaterali. Mantenere la piastra a 24 pozzetti con inserti permeabili nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 7-12 giorni fino a quando le cellule coltivate diventano completamente confluenti e viene raggiunto il valore TEER desiderato di circa 20 ohm per centimetro quadrato. Prima delle misurazioni TEER, posizionare la piastra a 24 pozzetti contenente celle nella cappa a flusso laminare a temperatura ambiente per 15-20 minuti per l'equilibrio della temperatura.
Per misurare il TEER per HRMEC, utilizzando un sistema di resistenza elettrica epiteliale volt / ohm, collegare l'elettrodo al misuratore e bilanciare l'elettrodo immergendolo prima in etanolo al 70% per 15-20 minuti e poi immergendolo brevemente nel terreno di crescita EGM della coltura cellulare. Eseguire la misurazione TEER immergendo accuratamente l'elettrodo, in modo che la punta più corta si trovi nell'inserto e la punta più lunga tocchi il fondo del pozzetto. Misurare prima la resistenza attraverso il controllo vuoto, quindi per ciascun inserto, misurare TEER in triplice copia.
Dopo aver raggiunto la confluenza con valori TEER di circa 20 ohm centimetri quadrati, privare le cellule del siero per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica utilizzando 0,5% FBS in EBM in entrambe le camere prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto. Incubare le cellule utilizzando il mezzo ridotto dal siero nella camera apicale con simano-3-tag fluorescente al ligando della transferrina per 60 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo aver lavato il monostrato apicale e basolateralmente 4 volte con il mezzo ridotto dal siero, aggiungere il mezzo fresco agli inserti filtranti contenenti le celle e trasferire gli inserti in pozzetti freschi della piastra a 24 pozzetti contenente il mezzo preriscaldato ridotto dal siero. Incubare le cellule per altri 90 minuti nell'incubatore e quindi raccogliere il mezzo dalla camera basolaterale. Registrare l'intensità di fluorescenza della soluzione dalla camera basolaterale utilizzando un rilevatore di fluorescenza.
Dopo aver raggiunto la confluenza con valori TEER di circa 20 ohm centimetri quadrati, privare le cellule del siero per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica utilizzando 0,5% FBS in EBM in entrambe le camere prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto. Quindi, trattare le cellule nella camera apicale con i trattamenti desiderati e i controlli del veicolo.
Aggiungere 5 milligrammi per millilitro di perossidasi di rafano, o HRP, alle cellule, e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero alla camera apicale e trasferire gli inserti in un pozzetto fresco contenente mezzi preriscaldati. Incubare il monostrato per altri 90 minuti nell'incubatore.
Dopo aver raccolto il terreno dalla camera basolaterale, aggiungere 100 microlitri di substrato di perossidasi fluorogenica HRP al mezzo raccolto e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Interrompere la reazione con 100 microlitri di soluzione di arresto e rilevare i livelli di prodotto di reazione del substrato HRP nel mezzo utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Prima di dimostrare i saggi di transcitosi in vitro, la visualizzazione della transcitosi delle cellule endoteliali nella retina viene mostrata come informazione di base.
Qui, l'immagine del microscopio ottico mostra un lume di vaso sanguigno riempito di HRP da una sezione retinica di topo selvatico di 3 mesi colorata con DAB. HRP è stato iniettato retroorbitalmente. I vasi retinici riempiti di HRP possono essere visti come precipitati marrone scuro al microscopio ottico.
La sezione ultrasottile del microscopio elettronico a trasmissione mostra vasi transcitotici riempiti di HRP con RMEC raffiguranti transcitosi EC attraverso la barriera emato-retinica interna. Qui, la grande vescicola riflette potenzialmente il macropinosoma e un globulo rosso sul lato del luminolo. L'immagine TeM mostra piccole vescicole transcitotiche riempite di HRP, probabilmente vescicole caveola, all'interno della RMEC.
La colorazione immunoistochimica dell'anticorpo CAV-1 e dell'isolectina B4 dimostra la localizzazione di CAV-1, un marker di vescicole caveola nei vasi sanguigni della retina, nella retina di topo wild-type di 3 mesi. L'immagine TeM del CAV-1 marcato con immunogold all'interno delle cellule endoteliali retiniche è mostrata qui con un'immagine ingrandita della vescicola caveola positiva al CAV-1. Per il test di transcitosi EC mediata da clatrina in HRMEC utilizzando transferrina, qui, un'immagine al microscopio a fluorescenza mostra la transferrina Cy3 endocitosa in colore rosso all'interno di HRMEC colorata con DAPI in blu.
Per la transcitosi EC mediata da caveole utilizzando HRP, la segnalazione Wnt qui viene utilizzata come esempio per dimostrare il test. Recentemente è stato scoperto che la segnalazione Wnt regola la transcitosi EC mediata da caveole. Le cellule sono state trattate con il mezzo Wnt3a-based dell'attivatore della via Wnt e Norrin ricombinante, con o senza l'inibitore della segnalazione Wnt XAV939 e i loro controlli reattivi.
Gli attivatori Wnt hanno ridotto il livello della transcitosi basata su HRP, che è stata invertita da XAV939. La corretta misurazione TEER è fondamentale per determinare l'integrità del monostrato. È fortemente influenzato da vari fattori come la manipolazione impropria, le fluttuazioni di temperatura, il terreno di coltura, la durata della coltura, eccetera.
Questo test potrebbe essere modificato come co-coltura o sistemi di coltura organotipica 3D che imitano le condizioni in vivo.
