Name: neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (supporto SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS) e il Centro di ricerca di tinnito di Lauer (KMS). Ringraziamo Jessica E. Sagers, BA per commenti insightful sul manoscritto.

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Assistenza e Assistenza Civile (IACUC) di Massachusetts Eye and Ear. Gli esperimenti sono stati condotti secondo il Codice Etico dell&#39;Associazione Medica Mondiale. 1. Preparazione della dissezione <ol><li> Preparazione del tavolo chirurgico <ol><li> Usa il 70% di etanolo per disinfettare il tavolo chirurgico. </li><li> Posizionare due pasticci nonsterili accanto al microscopio. </li><li> Preparare il vassoio strumenti, forbici operative a caldo sterilizzato, una maniglia per bisturi, un micro coltello e una pinza (due ciascuno di # 4 &amp; # 55). Posizionare il vassoio dello strumento e un piatto di petri da 50 mm, chiaro a parete, in vetro, su un tampone non sterile. </li><li> Ottenere una lama sterile # 15 a bisturi; Un sacchetto o contenitore di plastica sigillabile (per smaltire le carcasse in linea con gli orientamenti istituzionali); Ghiaccio in un secchio; E fredda, sterile Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS). Posizionare questi elementi sulAltro tampone nonsterile. </li><li> Trasferire l&#39;HBSS in un tubo di laboratorio di plastica da 50 ml e metterlo su ghiaccio. </li></ol></li><li> Preparazione della cultura <ol><li> Preparare tutti i materiali in un cappuccio flusso laminare. Per ogni quattro esemplari, mettere quattro vetri autoclavati di vetro da 10 mm scivolano nei quattro inlay del piatto da Petri di 4 pozzetti da 35 mm. </li><li> Per ogni 4 esemplari, miscelare un volume totale di 300 μL composto di seguito in un tubo di microcentrifuga: 10 μL di adesivo tissutale, 285 μL di NaHCO3 e 5 μL di NaOH. </li><li> Mettere 45 μL della soluzione risultante su ciascuna copertura di copertura e lasciarla lì per almeno 20 minuti a RT; Questa soluzione può essere lasciata sul coperchio per diverse ore ma non può essere lasciata O / N. </li><li> Posizionare uno o due piatti da Petri da 4 canali da 35 mm all&#39;interno di un piatto di Petri da 10 cm al fine di creare due barriere contro la contaminazione. </li><li> Preparare il mezzo di coltura contenente il 98% di Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1% N-2 e 1% ampicillina (65 μL per pozzetto in un tubo centrifugo (micro)). Riscaldare la soluzione a 25 ° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione Explorante Cochlear Murina <ol><li> Decapitazione del mouse neonatale <ol><li> Ottenete un piatto di petri di plastica da 60 millimetri e spruzzate il 70% di etanolo nel suo coperchio in modo che la superficie sia bagnata. </li><li> Versare il freddo HBSS dal tubo di laboratorio in plastica nella parte inferiore della plastica da 60 mm e dal piatto di Petri da 50 mm a parete chiara a vetro. Conservare il tubo di laboratorio in plastica e entrambi i piatti di Petri su ghiaccio per mantenere freddo il tessuto ogni volta che non viene disciolto. </li><li> Posizionare un mouse neonatale di età P3 - P5 in ghiaccio in un dito tagliente di un guanto di lattice e attendere che l&#39;ipotermia induca perdita di coscienza (circa 1-3 minuti). </li><li> Decapitate rapidamente il mouse con forbici operative e smalti il ​​corpo nel sacchetto di plastica sigillabile. Mettere la testa di neonato tagliata nella70% di etanolo nel coperchio del piatto di petri di plastica da 60 mm. </li></ol></li><li> Sezione macroscopica dell&#39;osso temporale <ol><li> Rimuove la pelle del cranio facendo un taglio superficiale dall&#39;anteriore all&#39;estremità posteriore (direttamente sulla sutura sagittale) usando la lama del bisturi. </li><li> Tagliare entrambi i canali uditivi esterni con la lama del bisturi e piegare la pelle anteriormente per esporre tutto il cranio. NOTA: sebbene non sia necessario un microscopio di dissezione per questo passaggio, può essere utilizzato per una migliore visualizzazione. </li><li> Aprire il cranio lungo la sutura sagittale utilizzando la lama # 15 a bisturi. Assicurarsi di tagliare il cranio spingendo delicatamente la lama su e giù da anteriore a posteriore per evitare la compressione delle coclee. NOTA: Il cranio non deve essere ossificato in questa età e dovrebbe tagliarsi facilmente. </li><li> Rimuovere e scartare il muso facendo un taglio verticale direttamente posteriore alle orbite usando il bisturi # 15lama. NOTA: la parte posteriore del cranio dovrebbe comunque contenere il cervello e le coclee. </li><li> Smaltire il forebrain, il cervelletto e il tronco cerebrale attraverso una dissezione sbarrata con # 4 pinze. </li></ol></li><li> Estrazione microscopica delle coclee <ol><li> Regolare il microscopio (ingrandimento 6.5X) e la sorgente luminosa mettendo la pinza sotto il campo di applicazione e ottimizzando l&#39;illuminazione e la messa a fuoco. </li><li> Posizionare le due metà del cranio nel piatto di petri di 60 mm riempito con HBSS freddo. </li><li> Completamente esporre la coclea / e, identificabile come adiacente all&#39;arteria stapediale circostante (un&#39;arteria tortuosa all&#39;interno dell&#39;osso temporale) e separare l&#39;organo esternamente dall&#39;oscurità temporale utilizzando # 4 pinze. </li><li> Trasferire la coclea nel piatto di Petri a 50 mm di fondo chiaro e posizionare il piatto sotto il microscopio. </li><li> Posizionare il piatto di petri di plastica da 60 mm con l&#39;altra metà del cranio sul ghiaccio. </li&gt; <li> Rimuovere la coclea dal sistema vestibolare e disciparle attentamente la capsula otterica coclea (tipicamente cartilaginea a questa età) con # 4 pinze. Usa # 55 pinze per tutti i passi successivi. </li></ol></li><li> Fasi finali dell&#39;elaborazione dei tessuti <ol><li> Continuare con l&#39;elaborazione del tessuto interno dell&#39;orecchio separando con attenzione il legamento a spirale aderente all&#39;organo di Corti dal resto della cochlea e dal modiolus usando il micro coltello o due pinze. <ol><li> Tagliare nella zona più scura e traslucida alla fessura tra il legamento a spirale e la regione delle cellule dei capelli e procedere alla successiva rimozione del legamento a spirale afferrandola all&#39;aspetto più basale e delicatamente svolgendola mentre si muove apicamente. </li></ol></li><li> Posizionare il campione per ottenere una vista longitudinale e sagittale della coclea e tagliare la coclea in due o tre sezioni usando il micro coltello, classificando queste sezioni come apicali, (medio) e bAsal gira. Rimuovere il tessuto superiore e inferiore allo strato effettivo di cellule e neuriti di capelli per ottenere un pezzo esplante cocleare che può giacere orizzontalmente sul piatto di Petri. NOTA: Una dimensione appropriata per un&#39;adeguata adesione al piatto di coltura è di circa metà di un giro cocholare. </li><li> Rimuovere la membrana tectoriale, un sottile strato traslucido immediatamente superiore all&#39;organo di Corti, levigandolo delicatamente con le pinze. </li><li> Rimuovere la membrana di Reissner, immediatamente superiori agli SGN, toccandola con le pinze da entrambi i lati e sbucciarla. NOTA: Rimuovere le zone celle danneggiate poste in posizione laterale tagliandole con il micro coltello. </li></ol></li></ol> 3. Trasferimento di esemplari ai piatti della coltura <ol><li> Rimuovere le 45 μL di soluzione adesiva tissutale dai quattro scivoloni di copertura. Lavare ogni copertura con 50 μl di H 2 O sterile. Aspirare l&#39;acqua. </li><li> Prendere la pipetta da 1 ml. Bagnare la punta della pipetta con circa 120 μL di DMEM per evitare che il campione si aderisca all&#39;interno della punta. </li><li> Trasferire i campioni individualmente usando la pipetta da 1 ml. Pipettate un massimo di 70 μl dal piatto petri a base di vetro pieno e parzialmente pieno, chiuso a tinta unita, e posizionare il campione insieme al liquido su uno dei 4 inlay (preparati con coperture) nel piatto Petri da 4 pozzetti . </li><li> Controllare sotto il microscopio (ingrandimento 50X) che il campione è nell&#39;orientamento corretto. Assicurarsi che l&#39;area delle cellule di capelli da cui è stata rimossa la membrana tectoriale sia rivolta verso l&#39;alto. Assicurarsi che la membrana basilare, insieme alla parte basale del modiolus, sia rivestita verso il basso e aderisce alla copertura. <ol><li> Se il campione è orientato verso l&#39;alto durante l&#39;ispezione, depositare l&#39;HBSS che rimane nella punta della pipetta nell&#39;intarsio e riposizionare il pezzo finché non è correttamente orientato. NOTE: Questo impedirà le cellule di capelli di galleggiare nel mezzo di coltura senza supporto strutturale dalla copertura, che potrebbe portare alla degenerazione. </li></ol></li><li> Aspirare l&#39;eccesso di HBSS utilizzando la pipetta da 1 ml. Attendere 15 s. </li><li> Pipettare direttamente sul campione 60 μl del mezzo di coltura caldo preparato (98% DMEM, 1% N-2 e 1% ampicillina). Fare attenzione a non toccare il campione con la pipetta. Sostituire i coperchi piatti di Petri interni ed esterni e incubare O / N a 37 ° C. </li><li> Riporre tutte le soluzioni di riserva nei propri luoghi, smaltire carcasse e residui di rifiuti, decontaminare il tavolo chirurgico secondo linee guida istituzionali ( ad esempio, utilizzando etanolo o ipoclorito), pulire e autoclave gli strumenti e scartare gli arnesi nel contenitore appropriato . </li></ol> 4. Aggiunta di Media Finale e Sostanze di Interesse NOTA: Gli esplosivi cochleari saranno pronti per l&#39;uso dopo 10-16 h. <ol><li> Preparare un miscuglio1% di N-2 e 1% di ampicillina (65 μl per pozzetto in un tubo di microcentrifuga, riscaldare la soluzione a 25 ° C prima dell&#39;uso), del 97% DMEM, 1% di siero di fegato fetale (FBS). </li><li> Aggiungere altre sostanze di interesse alle soluzioni per i rispettivi gruppi di trattamento. Se vengono aggiunte sostanze fluorescenti ( ad es. Virus che esprimono GFP), in una recente pubblicazione è stata utilizzata una concentrazione di 10 10 GC di virus adeno-associati (AAVs) per 48 h in 50 μL) 18 , proteggere da leggero. </li><li> Trasferire dall&#39;incubatore i piatti petri contenenti esplosivi cocleari e posizionarli sotto il cappuccio flusso laminare. </li><li> Aspirare il vecchio mezzo di coltura (senza FBS) con la pipetta dalle intarsi. </li><li> Aggiungere 60 μl per pozzetto del mezzo di preparazione (trattamento) caldo preparato (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillina e le sostanze di interesse). </li><li> Posizionare il piatto di Petri nell&#39;incubatore (37 ° C). </li><li> Visualizza rEgularmente sotto il microscopio per individuare segni di contaminazione, migrazione cellulare o distacco dell&#39;esplosione cochleare e eseguire la colorazione dopo un massimo di 7 giorni. </li></ol> 5. Immunofluorescenza - Giorno 1 <ol><li> Preparare la soluzione di blocco (94% di fosfato-tamponato salino (PBS), 5% normale caprino o cavallo di cavallo (NGS / NHS, a seconda degli anticorpi secondari) e 1% di tensioattivo non ionico (vedi tabella dei materiali ) Soluzione anticorpale (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% tensioattivo non ionico con i rispettivi anticorpi). NOTA: Gli anticorpi comprendono anti-Myo7A coniglio a una concentrazione di 1: 400+ (miosina 7A, per le cellule dei capelli interne ed esterne) e mouse anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, per SGNs) o topo (IgG1) anti (Densità postsinaptica, per postsynapse) e pollo anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilamento, anti-NF-H 1: Per SGN e fibre nervose). &quot;+&quot; MeaNs &quot;o superiore&quot;. </li><li> Aspirare il mezzo di coltura usando una pipetta. Fare attenzione a non toccare il campione. </li><li> Sotto la cappa a flusso laminare, risciacquare due esplosioni cochleari con PBS sterile, posizionando gli esemplari su un agitatore per 5 minuti dopo ogni lavaggio. </li><li> Fissare il tessuto in 4% di paraformaldeide (PFA - CAUTION) per 20 minuti sull&#39;agitatore (sotto la cappa). Aspirare il PFA. </li><li> Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x. </li><li> Posizionare gli esplosivi cochleari in soluzione di bloccaggio preparato (94% PBS, 5% NHS e 1% di tensioattivo non ionico) per 30 minuti in agitatore. </li><li> Posizionare gli esplosivi cochleari in una soluzione anticorpale di riserva preparata (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% tensioattivo non ionico) con i rispettivi anticorpi primari (vortex prima dell&#39;uso) O / N su un contatore a RT. NOTA: avvolgere i piatti di Petri con gli asciugamani umidi chiusi in un involucro di plastica (o foglio di alluminio se la soluzione aggiuntaIon contiene materiali fluorescenti come i virus che esprimono GFP) per mantenere i piatti umidi e per prevenire l&#39;evaporazione della soluzione anticorpale O / N. </li></ol> 6. Immunofluorescenza - Giorno 2 <ol><li> Preparare la macchia di 4 &#39;, 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) (300 nM) e utilizzare la soluzione anticorpale di riserva per ottenere le corrette miscele anticorpali secondarie complementari agli anticorpi primari del punto 5.1. ( Ad esempio , anti-coniglio caprino 488 1: 200+ e anti-topo caprino 568 1: 200+ ovvero anti-mouse caprino (IgG1) 568 1: 1000+, anti-mouse caprino (IgG2a) 488 1: 500+, E anti-pollo caprino 647 1: 200+ O Phalloidin 568 1: 200+ (per cellule capelli interne ed esterne)). </li><li> Aspirare la soluzione anticorpale primaria. </li><li> Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x. </li><li> Posizionare gli esplosivi cocleari in soluzione anticorpale di riserva preparata (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% non tensioattivo) con le resAnticorpi secondari pectivi (vortex prima dell&#39;uso) per 1,5 ore su un contatore e proteggendoli dalla luce. </li><li> Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e sciacquare gli esplosivi cochleari con una macchia DAPI (mettere su un agitatore per 1 min e poi aspirare). </li><li> Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x. </li><li> Usare le pinze per rimuovere le copertine con i campioni provenienti dalla piastra a 4 pozzetti, immergetele in un recipiente riempito di H 2 O distillato e asciugare le copertine verticalmente portandole a contatto con gli asciugamani. </li><li> Posizionare una goccia di mezzo di montaggio antifade sullo scivolo del microscopio e invertire le copertine per immergere il tessuto rivolto verso il basso nel mezzo. </li><li> Sigillare la copertura con un lucido chiodo che copre circonferenzialmente il bordo (senza schiacciare il campione sotto il vetro). Lasciare le diapositive che si trovano in una zona coperta lontano dalla luce per 15 - 20 minuti fino a quando non si asciugaLi metterli in una scatola o esaminare sotto il microscopio confocale. NOTA: La colorazione fluorescente è meglio conservata conservando le diapositive a 4 o -20 ° C. </li></ol> 7. Confocal Imaging <ol><li> Ottieni una panoramica e immagini ingrandite per l&#39;organo della regione Corti, comprese le neuriti e gli SGN. NOTA: Impostazioni standard per il processo di imaging: formato di 1.024 x 1.024 pixel, velocità di 400 Hz, media frame di 3, 20% di intensità laser complessiva e di solito 20X e 63X con immersione in olio (potenzialmente combinata con zoom digitale 2X). Le impostazioni dei canali per il protocollo di colorazione DAPI, Myo7A e TuJ1 sono descritte in precedenza: 405 5% DAPI, &quot;Smart Gain&quot; 766,8V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 488 15% fluoresceina isotiocianato (FITC), Smart Gain 622,2V , &quot;Smart Offset&quot; 0,0% - 561 13% tetrametilrhomadina isotiocianato (TRITC), &quot;Smart Gain&quot; 562,4V, &quot;Smart Offset&quot; 0,0%. </li><li> Unire le immagini in una z-stack usando il tastoSoftware per ottenere una proiezione di asse z. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+&amp;#34;recovered&amp;#34;+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &amp;#34;recovered&amp;#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea.">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li><li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector.">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes.">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li><li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear.">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

I ricercatori devono perfezionare la tecnica di dissezione prima di effettuare esperimenti che implicano esplosioni cochleari. Le cellule dei capelli sono comunemente danneggiate durante le dissezione eseguite presto nella curva di apprendimento e un momento particolarmente problematico per la loro integrità è la rimozione della membrana tectoria, che richiede mani costanti, strumenti e esperienze adeguate. Per risparmiare tempo e risorse, è necessario eseguire un controllo visivo sotto il microscopio di dissezione e...

Perdita uditiva sensoriale (SNHL) riflette danni all&#39;orecchio interno o al percorso uditivo ascendente. Mentre la perdita dell&#39;udito è il disordine sensoriale più comune nell&#39;uomo 1 , non esistono ancora terapie curative 2 . Sebbene gli impianti cerebrali cocleari o uditivi possono ristabilire un certo grado di udito ai pazienti con SNHL grave o profonda, l&#39;udienza fornita da questi dispositivi è ancora molto diversa da quella uditiva &quot;naturale&quot;, specialmente durante i tentativi di comprendere il rumore del suono o di ascoltare la musica. Mentre la degenerazione delle cellule di capelli è da tempo considerata la principale conseguenza degli eventi uditivi traumatici ( es. Esposizione a rumori elevati), vi è una crescente evidenza che le sinapsi che trasmettono informazioni dalle cellule dei capelli al nervo uditivo sono almeno altrettanto vulnerabili al trauma acustico 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . Poiché le soglie audiometriche umane, l&#39;attuale standard oro per la valutazione della funzione uditiva, non prevedono danni cellulari specifici nell&#39;orecchio interno, sono necessari strumenti più raffinati per rilevare la degenerazione cellulare quanto prima e per avviare un trattamento adeguato 7 . I trattamenti farmaceutici promettenti per la perdita dell&#39;udito sono spesso testati in culture cellulari omogenee in vitro , ma tali sistemi non modellano in modo preciso il microambiente cocleare. Le cellule cochleari sono noti per secernere fattori trofici che influenzano altri tipi di cellule all&#39;interno della coclea 8 , 9 , un processo cruciale in vivo che si perde quando l&#39;organo di Corti 10 , 11 o Neuroni Ganglionici Spirali (SGNs) 12 viene coltivato in isolamento o quando Vengono analizzati i marcatori molecolariTuttavia, studi in vivo che possono essere necessari per la convalida dei dati in vitro per stabilire nuovi trattamenti personalizzati per la perdita dell&#39;udito nel perseguimento della &quot;medicina di precisione&quot; richiedono risorse e tempi significativi. Quanto sforzo è necessario per perfezionare e realizzare iniezioni a membrana di orecchio medio o rotondo con test uditivi e la successiva dissezione di cochleari integrali. L&#39;efficace screening dei composti promettenti nelle colture ex vivo organotipiche noti come esplosioni cochleari fornisce un&#39;alternativa economica e affidabile 14 , 15 , 16 , 17 . Questo articolo descrive un protocollo per generare, mantenere e valutare gli esplosivi cocleari trattati. Le applicazioni specifiche per questo modello vengono enfatizzate, tra cui l&#39;utilizzo nell&#39;ambito dello screeningDi composti potenzialmente terapeutici e la valutazione comparativa dei vettori virali per la terapia genica. Un approccio esplosivo ex vivo consente ai ricercatori di visualizzare gli effetti di un dato trattamento su diverse popolazioni cellulari in situ , facilitando l&#39;identificazione dei meccanismi specifici di tipo cellulare e la successiva affinamento di terapie mirate. Nel complesso, questa tecnica fornisce un modello per studiare la coclea ex vivo , preservando la conversazione vitale tra i diversi tipi di cellule che coesistono all&#39;interno della coclea.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H antibody, chicken</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td><td>Antibodies Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&amp;reg;, Sleeve/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260368</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&amp;nbsp;</td><td>Aliquot in 50 mL tubes and store in -20&amp;deg;C freezer</td></tr><tr><td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro (dissecting) knife &amp;ndash; angled 30&amp;deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1&quot;), 1 mm thick, white, pack of 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&amp;nbsp;</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Prep Pad, Non Sterile&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6&#039;&#039; - 2 mm thick</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research

Mentre negli ultimi decenni sono stati notevoli progressi nella ricerca uditiva, non esiste ancora cura per la perdita di udito sensoriale (SNHL), una condizione che tipicamente comporta danni o perdite delle delicate strutture meccanosensoriali dell&#39;orecchio interno. Nel corso degli ultimi anni sono emersi sofisticati esami in vitro e ex vivo, che hanno permesso lo screening di un numero crescente di composti potenzialmente terapeutici, minimizzando le risorse e accelerando gli sforzi per sviluppare cure per SNHL. Sebbene colture omogenee di alcuni tipi di cellule continuino a svolgere un ruolo importante nella ricerca attuale, molti scienziati ora si affidano a culture organotipiche più complesse di orecchie interne murine, noti anche come esplorazioni cochleari. La conservazione delle strutture cellulari organizzate all&#39;interno dell&#39;orecchio interno facilita la valutazione in situ di vari componenti dell&#39;infrastruttura coclea, comprese le cellule dei capelli interni ed esterni, i neuroni dei gangli spirali, i neurE supportare le cellule. Qui presentiamo la preparazione, la cultura, il trattamento e l&#39;immunostaining di esplosioni cochleari murine neonatali. L&#39;attenta preparazione di questi esplosivi facilita l&#39;individuazione di meccanismi che contribuiscono alla SNHL e costituisce uno strumento prezioso per la comunità di ricerca uditiva.

Mentre molti protocolli si concentrano sull&#39;organo di Corti explants, questa tecnica tenta di preservare l&#39;anatomia dell&#39;intero turno cochleare, inclusi gli SGN. Questo dà ai ricercatori l&#39;opportunità di analizzare gli effetti di un dato trattamento sulle neuriti e sulla somata di SGN oltre all&#39;organo di Corti. Effettuare una dissezione che conserva parte del modiolus, come descritto qui, è più tecnicamente impegnativo che esplodere l&#39;organo di Corti da solo. ...

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Tecnica di espianto cocleare murino neonatale come strumento di screening in vitro nella ricerca sull'udito | Medicina | Video

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l&#39;immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un<em&gt; In vitro</em&gt; Strumento di screening nella ricerca acustica

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

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17.5K Views.  Massachusetts Eye and Ear.  L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

Making Sense di Ascolto: La batteria di test IMAP

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

Medicina

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Biologia

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neuroscienze

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Espianti cocleari neonatali interi come modello in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Coltivazione efficiente in vitro di cellule ciliate cocleari di topo

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Autore in primo piano: Progressi nella coltivazione di cellule ciliate di topo per la ricerca uditiva 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un

Riepilogo

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