Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) con il numero di sovvenzione FO 315/4- e del Programma dell&#39;Unione Europea Settimo programma quadro (FP7/2007-2013) Convenzione di sovvenzione n HEALTH-F2-2009-241.778 a CF.

1. Semina delle cellule endoteliali in pozzetti <ol><li> Coltivare microvascolari cerebrali cellule endoteliali murine (CEND) in beuta T75 cultura, cambiando il medium (DMEM contenente 10% FCS, 50 U / ml di penicillina / streptomicina, 1% di L-glutammina) due volte a settimana, fino al raggiungimento confluenza. (Per la generazione e immortalization del cervello cellule endoteliali microvascolari, vedere Burek et al, 2012;. Förster et al, 2005 21,19.). </li><li> Lavare le cellule con tampone fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e trypsinize le cellule con 2 ml di soluzione di tripsina-EDTA caldo. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando lo strato di cellule è disperso. </li><li> Aggiungere 8 ml di terreno di coltura nelle cellule. Toccare il pallone più volte per staccare le cellule. </li><li> Visualizzare le cellule sotto il microscopio per garantire il completo distacco dal pallone. </li><li> Pipetta medie con le cellule staccate su e giù. Agitare il pallone per mescolare il suspensi cellaon. </li><li> Prendere 20 microlitri della sospensione cellulare, messo in un emocitometro e contare il numero di cellule. </li><li> Determinare la densità cellulare e sementi 20.000 cellule / cm 2 nel pozzo. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in collagen1 prerivestita 6 pozzetti con fondo flessibile piastre di coltura (57,75 centimetri 2) in un volume totale di 3 ml / pozzetto. Ogni bene ha una superficie di 9,62 centimetri 2. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C per una settimana fino confluenti. Cambia il terreno di coltura due volte a settimana. </li></ol> 2. Differenziamento Cellulare Prima Infortunio Stretch indotta <ol><li> Cambiare il mezzo di coltura delle cellule con terreno di differenziamento (DMEM contenente 1% di siero-messo a nudo siero fetale di vitello (ssFCS), 50 U / ml di penicillina / streptomicina). </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 24 hr. </li></ol> 3. Infortunio Stretch indotta delle cellule endoteliali <ol><li> Accendere il dispositivo di controllo danno cellulare. </li><li> Impostare il ritardo di 50 msec. </li><li> Impostare il regolatore di pressione a 15 psi e premere il grilletto un paio di volte fino a quando la pressione di picco registrato diventa stabile. </li><li> Impostare il regolatore di pressione al valore desiderato. Utilizzare la Tabella 1 come guida per generare vari gradi di lesioni stirata. </li><li> Posizionare la piastra di coltura flessibile a fondo da 6 pozzetti (57,75 centimetri 2) nel supporto del vassoio. Assicurarsi che il selettore sia impostato bene alle dimensioni ben corretto (cioè gran bene). </li><li> Posizionare l&#39;adattatore saldamente sopra il pozzo. Tenere saldamente la spina in posizione con una mano mentre l&#39;altra mano spinge il grilletto. </li><li> Registrare la pressione di picco generata. </li><li> Mettere immediatamente la piastra posteriore nella 37 ° C incubatore per il tempo desiderato o utilizzare immediatamente per riuscire esperimenti o di valutazione. </li></ol> 4. Valutazione della Stretch lesioni da Dye assorbimento Assay <ol><li> Subito dopo le cellule erano stracidato (passo 3.7), aggiungere 30 ml di un mg / ml soluzione della viabilità macchia 1 che agisce come un marcatore di citotossicità (per favore consultate la tabella dei materiali e delle attrezzature) al mezzo di coltura cellulare (Nota: 10 microlitri della soluzione colorante è da utilizzare per ogni ml di mezzo di coltura cellulare). </li><li> Dopo l&#39;aggiunta del colorante alle cellule, visualizzare immediatamente sotto un microscopio a fluorescenza. </li></ol> 5. Valutazione della Stretch lesioni da lattato deidrogenasi (LDH) uscita <ol><li> Subito dopo l&#39;allungamento delle cellule (passo 3.7), rimuovere 200 pl di mezzo di coltura cellulare dal pozzo. Fare lo stesso per ogni punto di tempo post-infortunio si desidera includere nella vostra indagine di rilascio di LDH (cioè ad esempio 30 minuti, 1 ora, 2 ore, ecc.) </li><li> Centrifugare il mezzo di coltura cellulare alla massima impostazione di una microcentrifuga per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Rimuovere il surnatante e utilizzare questo per i passi successivi. </li><li> Una volta che have finito passo 5.1 e hanno preso i necessari campioni che vorreste avere da vari punti di tempo che si desidera indagare, lisare le cellule utilizzando la soluzione di lisi incluso nel LDH test kit (vedi tabella supplementare dei materiali e delle attrezzature). </li><li> Mettere 100 ml di terreno di coltura inclusa nel saggio kitto ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti fornito nel kit. </li><li> Mettere 100 ml di mezzo di coltura cellulare esente da cellule in due pozzetti paralleli di una piastra a 96 pozzetti incluso nel kit di analisi. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per 30 min. </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 492 nm. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Gli effetti di lesioni meccaniche in vitro sono stati studiati e sono stati stabiliti metodi per astrociti, neuroni, cellule gliali e cellule endoteliali aortiche 8, 9, 22. Vi è, tuttavia, a tutt&#39;oggi ancora noto modello in vitro di lesioni tratto in cellule endoteliali coltivate cerebrali. Modelli cellulari di trauma forniscono importanti vantaggi rispetto ai modelli animali poiché l&#39;ambiente meccanico delle cellule può essere controllato con precisione 6. Quindi, un modello in vitro per il trauma per infortunio tratto utilizzando cellule endoteliali cerebrali che agiscono come modello della barriera emato-encefalica (BBB), come quello che il nostro protocollo di regali possono rivelarsi utili. Questo protocollo fa uso di cellule CEND, un modello BBB stabilito nel nostro laboratorio. Dal ripartizione BBB è spesso documentato in pazienti con trauma cranico e trauma cranico è spesso legata alla rottura della BBB, che può portare a formazione di edema 23, 24, il metodo di presented qui possono specificamente essere utilizzato nella realizzazione di studi BBB in relazione al trauma cranico. In questo modello, è importante prendersi cura di quanta grado di lesione stirata viene applicata alle celle. In quanto le cellule rimangono ferite in ogni caso, e con qualunque quantità di pressione viene applicata, il grado di danno che può influenzare le cellule endoteliali differiscono molto notevolmente da altri tipi di cellule. Cellule endoteliali aortiche sono più resistenti di allungare infortunio di astrociti o cellule gliali miste 9. Inoltre, riparano più rapidamente dopo lesione rispetto agli altri tipi di cellule. Pertanto, per cervello cellule endoteliali, cellule, particolarmente cend maggiore quantità di lesione stirata è necessaria per produrre un alto grado di lesione. Si potrebbe raggiungere il grado desiderato di lesione applicando la pressione corrispondente indicato nella tabella 1. Per le cellule CEND, tuttavia, lesioni gravi è preferito a causa della loro resistenza allo sforzo. I test condotti hanno dimostrato LDHche come aumenta il grado di stirata, più LDH è secreta nel supernatante. Al contrario, le cellule che sono stati dati una bassa quantità di lesioni prodotte tratto LDH in una quantità simile alle cellule di controllo. Come menzionato nel protocollo, si deve fare attenzione che la quantità appropriata di terreno è usato in quanto un aumento o una diminuzione della quantità di mezzo può provocare a differenze nella pressione di picco applicata ai pozzetti. Per esempio, un pozzetto contenente 5 ml di liquido registra una pressione di picco nella media 4,0 psi mentre un pozzetto vuoto registra una media di 3,8 psi quando viene applicata pressione 45 psi. Pertanto, è meglio per spingere il grilletto più volte nel corso di un controllo bene per assicurare che la pressione di picco che viene generato corrisponde alla quantità desiderata. Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato una vitalità macchia per determinare l&#39;effetto di allungamento alla permeabilità della membrana cellulare. L&#39;ottica delle piastre di coltura flessibile a fondo abbiamo utilizzato ci permette di VIew le cellule colorate direttamente sotto il microscopio. Tuttavia, quando si vuole condurre studi immunolabelling direttamente dopo la stiro-infortunio, possono sorgere difficoltà. In primo luogo, la dimensione e lo spessore della piastra possono rappresentare un problema con alcune piattaforme di osservazione al microscopio. In secondo luogo, l&#39;ottica della membrana flessibile del pozzo possono essere un ostacolo per cancellare la visualizzazione. Nonostante i limiti suddetti, tuttavia, la procedura descritta può essere utilizzata come modello in vitro di lesioni meccaniche della BBB. Lesione cerebrale traumatica (TBI) implica due componenti, vale a dire, l&#39;ischemia e il trauma. Ischemia può verificarsi come una lesione secondaria seguente TBI in casi in cui si abbia una grave perdita di sangue con conseguente bassa pressione sanguigna o come risultato di rigonfiamento cerebrale limitare l&#39;apporto di ossigeno al cervello. E &#39;considerato come un ritardato, danno non meccanico rappresentazione di processi patologici consecutivi avviati al momento della lesione 25. Il verificarsi di una ipossiagrave trauma cranico opo è comune 26. Ossigeno deprivazione di glucosio (OGD) è il metodo attualmente utilizzato per modellare l&#39;ischemia in vitro. Così, sottoponendo le cellule a OGD come un insulto secondario alle cellule dopo stiramento può imitare l&#39;incidenza di TBI seguito da ischemia. Quindi, per migliorare il nostro attuale modello in vitro di TBI e modello il più vicino possibile ad un TBI reale come avviene in vivo, in futuro ci sarà anche impiegare OGD in combinazione con lesioni stirata.

Lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Circa 10 milioni di persone sono colpite ogni anno da TBI rendendolo un importante problema sanitario e medico 1. A causa di questo, diversi in vivo e in vitro di trauma cranico sono stati stabiliti e sviluppato per studiare i meccanismi di 2,3,4. Una migliore comprensione del trauma cranico può contribuire a migliorare il trattamento del paziente e diminuire la mortalità associata, morbilità e costi. Molti modelli per lesioni cerebrali che utilizzano sia in vivo che in vitro esistono metodi. Modelli in vivo potrebbe imitare l&#39;evento reale della lesione alla testa. Tuttavia, a causa della complessità della situazione in vivo, accessibilità al tessuto di interesse diventa limitato 2. Nella comprensione della risposta fisiologica delle singole celle come conseguenza della ferita inflitta, è importante che le cellule sono isolate dagli effetti sistemici chepuò inibire o alterare la loro risposta individuale 5. Per questo motivo, modelli cellulari di trauma forniscono utili vantaggi rispetto modelli animali poiché l&#39;ambiente meccanico delle cellule può essere controllato con precisione 6. Sistemi in vitro che impiegano l&#39;uso di carico meccanico alle cellule o tessuti di determinare alterazioni indotte da tale metodo di lesione sono stati sviluppati. Ad esempio, è stato stabilito un metodo per studiare l&#39;effetto di danno meccanico alle cellule di astrociti, neuroni, cellule gliali e cellule endoteliali aortiche 7,8,9. Il modello in vitro trauma stabilito per lo studio dei roditori e reattività astrociti umani 10 impiegato un dispositivo di controllo della pressione identico a quello che usiamo per il nostro modello. Lo stesso metodo è stato applicato per indurre lesioni attraverso tratto in topo cervello microvasi cellule endoteliali (bEnd3) 11 e neuroni corticali 12,13 nonché, endoth cerebralecellule Elial da suinetti neonati 14. Il dispositivo deforma il fondo della cultura ben producendo pertanto un grave stiramento meccanico 10. Essa infligge lesioni upon cellule coltivate mediante l&#39;applicazione di pressione aria sopra le celle. Questa pressione può deviare la membrana su cui le cellule crescono, allungando così le celle. Vari gradi di stiramento (cioè &quot;basso&quot; moderato &quot;o&quot; grave &quot;) può essere raggiunto impostando la durata dell&#39;impulso di pressione dell&#39;aria e l&#39;intensità di conseguenza. Questo metodo di lesioni all&#39;allungamento indotto è stato correlato con lesione traumatica in vivo 7. Inoltre , questo metodo consente di lesioni per il preciso controllo dell&#39;ambiente extracellulare e può essere facilmente riprodotta. Anche se un approccio simile è stato utilizzato per molti altri tipi di cellule del cervello, comprese bEnd3, il nostro modello è di un vantaggio in quanto fa uso del cervello microvascolari cellule endoteliali murine (CEND) generatonel nostro laboratorio. Questa linea cellulare è un modello molto adatto della barriera emato-encefalica (BBB). Colture cellulari in vitro utilizzati come modelli BBB deve possedere caratteristiche tali da consentire loro di servire come schermo di permeabilità. Un criterio importante per un modello in vitro di cellule di essere un predittore di BBB permeabilità è che dovrebbe possedere un&#39;architettura cellulare fisiologicamente realistico 15. Anche se bEnd3 celle visualizzano distintivo mandrino-come morfologia squamose nella cultura 16, esibiscono un comportamento irregolare morfogenetica in vitro in cui si formano cavità simili a cisti piuttosto che le normali strutture tubolari in fibrina gel 17. Inoltre, quando le cellule sono state iniettate in topi embrionali e neonatale, hanno indotto in rapida crescita dei tumori letali per topi embrionali, ma non nei topi neonati e giovani. Si propone quindi che uno o più processi che regolano il normale crescita endoteliale, la migrazione e la differenziazione sono stati alterati o elimied in questa linea cellulare 18. D&#39;altra parte, morfologiche, valutazione immunocitochimica di misure di flusso endoteliali ed espressione marcatore BBB, bioelettrica, e paracellular dimostrano che il nostro modello BBB CEND è infatti un modello adatto della BBB 19. Endotelio cerebrale in vivo è caratterizzato da una permeabilità estremamente stretta con trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) compresi tra 2,000-5,000 Qcm 2. Per gli studi di cervello microcircolo proprietà barriera ai prodotti farmaceutici, devono essere considerati restrittività paracellulare e tenuta delle cellule. Nella maggior parte dei capillari del cervello cellule endoteliali (BCEC), questo non è conservato come cellule mostra TEER vanno 50-100 Qcm 2 20. Il cervello endoteliale linea bEnd3 cellulare immortalata genera valori TEER non superiori a 60 Qcm 2 15. In contrasto con la differenziazione delle cellule CEND con terreno contenente siero ridotto visualizzazioneValori che vanno TEER 300-500 Qcm 2 19,21. Ad oggi, in modelli in vitro di lesioni tratto in cellule endoteliali cerebrali coltivate sono scarse. Quindi, un modello in vitro per il trauma per infortunio tratto utilizzando cellule endoteliali cerebrali che agiscono come modello della BBB potrebbe rivelarsi utile. In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro che possono mimare l&#39;impatto effettivo che le cellule del cervello, in particolare il cervello cellule endoteliali microvascolari del BBB, ricevono durante TBI. Il vantaggio principale di questo modello è che la quantità di lesione applicata alle celle nonché l&#39;ambiente extracellulare può essere facilmente controllato in maniera precisa, che consenta un facile riproducibilità sperimentale di set-up.

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	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Cell Injury Controller II</td>
			<td style="width:351px;">Custom Design and Fabrication, Virginia, USA</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:431px;"></td>
			<td style="width:435px;">http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name of Materials</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Remarks</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bioflex Culture Plate - Collagen Type I</td>
			<td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td>
			<td>BF - 3001C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:351px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">D5796</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td style="width:143px;">A15110-1333</td>
			<td style="width:431px;">final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 &#176;C)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0282</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">MEM Vitamin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0373</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Na-pyruvate</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">L0473</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Nonessential amino acids (NEA)</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">K0293</td>
			<td style="width:431px;">Storage at 4 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td style="width:351px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:143px;">A2212</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS)</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>12676-011</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:351px;">PAA Laboratories</td>
			<td>L11-004</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image-iT DEAD Green</td>
			<td style="width:351px;">Life Technologies</td>
			<td>I10291</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C, protected from light</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4744926001</td>
			<td style="width:431px;">Storage: &#8804; -15 &#176;C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stretch in brain microvascular endothelial cells (cend) as an in vitro traumatic brain injury model of the blood brain barrier

A causa dell&#39;incidente elevata mortalità causata da lesioni cerebrali traumatiche (TBI), metodi che consentano di comprendere meglio i meccanismi di fondo che lo praticano sono utili per il trattamento. Ci sono sia in vivo che in vitro metodi disponibili per questo scopo. In vivo modelli possono mimare trauma cranico effettivo, come avviene durante TBI. Tuttavia, nelle tecniche in vivo non può essere sfruttato per studi a livello fisiologia cellulare. Quindi, metodi in vitro sono più vantaggiose per questo scopo in quanto forniscono un più facile accesso alle celle e l&#39;ambiente extracellulare per la manipolazione. Il nostro protocollo presenta un modello in vitro di lesioni distensione usando TBI in cellule endoteliali microvascolari cerebrali. Esso utilizza la pressione applicata alle cellule coltivate in pozzetti a fondo flessibile. La pressione applicata può essere facilmente controllata e può produrre lesioni che varia da bassa a grave. Il murinomicrovascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) generati nel nostro laboratorio è un modello molto adatto per la barriera emato-encefalica (BBB), fornendo così un vantaggio per altri sistemi che utilizzano una tecnica simile. Inoltre, grazie alla semplicità del metodo, nelle configurazioni sono facilmente duplicati. Così, questo modello può essere utilizzato nello studio dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella TBI presso la BBB.

Cellule coltivate su collagene I fase solida piastre di coltura fondo 6 pozzetti flessibili (57,75 centimetri 2) sono stati sottoposti a vari gradi di lesioni tratto utilizzano il dispositivo barella cella. Dopo sottoponendo le cellule al danno, essi sono stati esaminati al microscopio per gli effetti di lesioni all&#39;allungamento indotto a morfologia cellulare. È stato osservato che una maggiore grado di allungamento è stata applicata alle celle potrebbe essere rilevato anche un maggior grado di distorsione cella (Figura 1). Come mostrato in figura 1A, cellule di controllo che non sono stati sottoposti a lesione appaiono come cellule endoteliali cerebrovascolari forma regolare (CEND) senza indicazione di gonfiore cella o distorsione. Quando è stato applicato lesioni tratto (Figure 1B-D), deformazione poteva essere osservato al microscopio ottico. Dopo l&#39;allungamento delle cellule gravemente con una pressione di picco tra 3,5-4,5 psi, le cellule CEND apparsi nettamente retratto, gonfie e deformate con non<html> spazi intercellulari capaci. Inoltre, l&#39;assorbimento di vitalità macchia (concentrazione finale 100 nM) anche aumentato il grado di lesione allungamento è stato aumentato (Figura 2). La vitalità macchia usato è un colorante impermeant alle cellule sane che diventa permeanti quando l&#39;integrità della membrana plasmatica delle cellule è compromessa. Il colorante è stato escluso dalla maggior parte delle cellule di controllo, quindi, solo alcune delle cellule sono state colorate (Figura 2A) rispetto alle cellule allungate (figure 2B-D). Altre cellule fluoresced verde con un aumentato grado di lesione tratto. Come marcatore biochimico di danno, il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) enzima è stato inoltre esaminato in base alle istruzioni del produttore. Figura 3 mostra che una lesione tratto cella crescente causato l&#39;aumento di rilascio di LDH. 928/50928fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figura 1. Esame al microscopio ottico di cellule normali vs feriti. (A) normale distenderla monostrato di cellule confluenti istightly imballato e allungata. Quando le cellule sono state tese applicando un impulso di pressione di picco di 1,8-2,0 psi (cioè basso allungamento) appaiono meno compatto, spazi indicati da frecce (B). Quando le cellule sono state moderatamente lesa con un picco di impulso di pressione 2.5-3.0, alcuni di loro è apparso gonfio e deformato (C). Le cellule diventano retratti con grave tratto di 3,5-4,5 psi, come indicato dalla freccia (D). Ingrandimento 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" /> Figura 2. Fluorescence esame al microscopio delle cellule normali vs feriti cellule trattate con vitalità 2h macchia dopo l&#39;infortunio A: controllo di cellule unstretched BD: cellule allungate (B - basso, C - moderato, D - grave).... Ingrandimento 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Lattato deidrogenasi (LDH) enzima rilascio nel surnatante dopo la lesione tratto. LDH rilasciata nel mezzo di coltura è stata misurata a vari intervalli di tempo dopo stiramento lesione indotta. LDH è stata espressa come percentuale del totale rilasciabile LDH (LDH in Media Plus cellule). I valori sono ± SEM. Il n per ogni punto di tempo è 5, tranne per il 0 hr valore sottoposto a grave tratto dove n = 3. Rilascio di LDH da celle che sono state sottoposte a basso e moderato stirata non differisce significativamente da quella dei controlli unstretched e una dall&#39;altra. Celle che sono state gravemente allungati rilasciato una quantità significativamente maggiore di LDH rispetto a tutti gli altri campioni, ad eccezione del campione moderatamente allungato, su 1 ora. (P &lt;0.05, ANOVA Un fattore, metodo di Holm-Sidak). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . Tabella 1. Guida per la generazione di vari gradi di lesioni tratto. <table border="1"><tbody><tr><th> Regolatore di pressione </th><th> Picco di pressione </th><th> Grado di lesione </th></tr><tr><td> 15 psi </td><td> 1,2-1,5 psi </td><td> &lt;Basso </td></tr><tr><td> 20-25 psi </td><td> 1,8-2,0 psi </td><td> Basso </td></tr><tr><td> 30-35 psi </td><td> 2,5-3,0 psi </td><td> Moderato </td&gt; </tr><tr><td> 40-50 psi </td><td> 3,5-4,5 psi </td><td> Grave </td></tr><tr><td> 60 psi </td><td> 4,8-6,0 psi </td><td> &gt; Grave </td></tr></tbody></table>

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Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro modelli di lesioni cerebrali traumatiche sono state sviluppate per riprodurre in deformazione del cervello in vivo. Lesioni Stretch indotta è stato impiegato per gli astrociti, neuroni, cellule gliali, aortica, e le cellule endoteliali cerebrali. Tuttavia, il nostro sistema utilizza una barriera emato-encefalica (BBB), modello che possiede le proprietà che costituiscono un modello legittimo della BBB di stabilire un modello in vitro TBI.

Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come<em&gt; In Vitro</em&gt; Trauma cranico modello della barriera ematoencefalica

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

14.8K Views.  Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg.  In vitro modelli di lesioni cerebrali traumatiche sono state sviluppate per riprodurre in deformazione del cervello in vivo. Lesioni Stretch indotta è stato impiegato per gli astrociti, neuroni, cellule gliali, aortica, e le cellule endoteliali cerebrali. Tuttavia, il nostro sistema utilizza una barriera emato-encefalica (BBB), modello che possiede le proprietà che costituiscono un modello legittimo della BBB di stabilire un modello in vi...

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

MRI-guidato Interruzione della barriera emato-encefalica transcranica con ultrasuoni focalizzati in un modello murino

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

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Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Modello Rat di emato-encefalica Turbativa Barriera per consentire mirato Therapeutics neurovascolare

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI). Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, social, and economical effects are staggering. Therefore, further research into the effects of TBI and effective treatments is necessary. The controlled cortical impact (CCI) model induces traumatic brain injuries ranging from mild to severe. This method uses a rigid impactor to deliver mechanical energy to an intact dura exposed following a craniectomy. Impact is made under precise parameters at a set velocity to achieve a pre-determined deformation depth. Although other TBI models, such as weight drop and fluid percussion, exist, CCI is more accurate, easier to control, and most importantly, produces traumatic brain injuries similar to those seen in humans. However, no TBI model is currently able to reproduce pathological changes identical to those seen in human patients. The CCI model allows investigation into the short-term and long-term effects of TBI, such as neuronal death, memory deficits, and cerebral edema, as well as potential therapeutic treatments for TBI.

Traumatic brain injuries (TBIs) remain a serious health problem. Using the controlled cortical impact surgery model, research on the effects of TBI and possible treatment methods may be performed.

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Novel Model of Mild Traumatic Brain Injury for Juvenile Rats

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor vehicle accidents, and falls, a reliable animal model of mTBI had previously not been developed for this important aspect of development. The modified weight-drop technique employs a glancing impact to the head of a freely moving rodent transmitting acceleration, deceleration, and rotational forces upon the brain. When applied to juvenile rats, this modified weight-drop technique induced clinically relevant behavioural outcomes that were representative of post-concussion symptomology. The technique is a rapidly applied procedure with an extremely low mortality rate, rendering it ideal for high-throughput studies of therapeutics. In addition, because the procedure involves a mild injury to a closed head, it can easily be used for studies of repetitive brain injury. Owing to the simplistic nature of this technique, and the clinically relevant biomechanics of the injury pathophysiology, the modified weight-drop technique provides researchers with a reliable model of mTBI that can be used in a wide variety of behavioural, molecular, and genetic studies.

The modified weight-drop technique is an easy, cost-effective procedure used for the induction of mild traumatic brain injury in juvenile rats. This novel technique produces clinically relevant symptomology that will advance the study of mild traumatic brain injury (mTBI) and concussion.

Un modello Novel di Mild Traumatic Brain Injury per ratti giovani

Despite growing evidence that childhood represents a major risk period for mild traumatic brain injury (mTBI) from sports-related concussions, motor ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

L&#39;ossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Mouse Model of Single and Repetitive Mild Traumatic Brain Injury

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal neurological deficits and even amnesia. Athletes participating in contact sports are at high risk of exposure to large number of mTBIs. In terms of the level of injury in a sporting athlete, a mTBI is defined as a mild injury that does not cause gross pathological changes, but does cause short-term neurological deficits that are spontaneously resolved. Despite previous attempts to model mTBI in mice and rats, many have reported gross adverse effects including skull fractures, intracerebral bleeding, axonal injury and neuronal cell death. Herein, we describe our highly reproducible animal model of mTBI that reproduces clinically relevant symptoms. This model uses a custom made pneumatic impactor device to deliver a closed-head trauma. This impact is made under precise velocity and deformation parameters, creating a reliable and reproducible model to examine the mechanisms that contribute to effects of single or repetitive concussive mTBI.

Athletes absorb several hundred mild traumatic brain injuries (mTBI)/concussions every year; however, the consequence of these on the brain is poorly understood. Therefore, an animal model of single and repetitive mTBI that consistently replicates clinically relevant symptoms provides the means to advance the study of mTBI and concussion.

Un modello di mouse del singolo e ripetitivo dolore cerebrale traumatico lieve

Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) can result in the acute loss of brain function, including a period of confusion, a loss of consciousness (LOC), focal ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...