Questo metodo affronta le sfide nell'osservazione profonda della fluorescenza nei germogli di riso, come una limitata penetrazione tissutale della soluzione di compensazione e la risoluzione reale al microscopio confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'osservazione della struttura di tessuti molto grandi da una prospettiva macro, anche sollecita con tessuti duri e spessi, come i germogli adulti. Questo metodo si applica all'imaging profondo di tessuti duri e spessi in specie vegetali di grandi dimensioni.
Può aiutare ad accelerare la scoperta di nuovi fenomeni nella ricerca biologica vegetale. Per iniziare, tagliare le radici con cura senza danneggiare le piante e lavarle con acqua per rimuovere lo sporco. Ora, usa le pinzette per staccare le vecchie foglie esterne.
Per evitare di schiacciare le cellule, utilizzare un rasoio a taglio singolo con un movimento scorrevole per tagliare il tessuto dal germoglio, dal meristema apicale o dalla giovane pannocchia alla base. Se la posizione del meristema apicale del germoglio o della giovane pannocchia non è visibile, tagliarla più a lungo. Il germoglio di riso ha una sezione trasversale ovale.
Usa un rasoio a doppio taglio per radere un lato dell'ovale sottilmente, nella direzione del suo asse lungo. Confermare la posizione del meristema apicale del germoglio o della giovane pannocchia con la comparsa di un colore bianco-astre nel campione e tagliare il tessuto in eccesso. Mettere il campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di soluzione fissativa.
Tagliare un pezzo di pellicola di paraffina di 2,5 centimetri quadrati e modellarlo in una palla. Ora, posiziona queste sfere sopra i campioni per evitare che fluttuino fuori dalla soluzione fissativa. Porre la provetta contenente il campione in un essiccatore.
Chiudere il coperchio dell'essiccatore e avviare la pompa per vuoto per depressurizzare lentamente l'interno dell'essiccatore fino a raggiungere una pressione di meno 0,095 megapascal. Dopo aver chiuso l'essiccatore a meno 0,095 megapascal, spegnere la pompa per vuoto e lasciarla riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aprire leggermente l'essiccatore e riportarlo lentamente alla pressione atmosferica.
Se il campione è fissato correttamente, affonda nella soluzione fissativa. E se non affonda, ridurre nuovamente la pressione. Rimuovere la pellicola di paraffina.
Chiudere il coperchio e tenere i tubi durante la notte a quattro gradi Celsius. Utilizzando salviette prive di lanugine, rimuovere la soluzione fissativa in eccesso dal campione e fissare il campione su un vassoio vibrante per micro-affettatrici con colla istantanea. Posizionare il campione su un vassoio con il lato piatto verso il basso che è stato rasato durante il campionamento e impostare le condizioni di rifilatura in base al campione fissato.
Regolare la posizione del campione con il pulsante di inversione o avanti e il pulsante su o giù e riempire il vassoio con acqua deionizzata fino a quando tutti i campioni sono immersi. Dopo aver riempito il vassoio, premere il pulsante di avvio e posizionare i campioni tagliati su un vetrino con una goccia di PBS. Controllare il campione contenente il sito target al microscopio stereo e trasferire il campione tagliato su una piastra multi-pozzetto con un millilitro di PBS.
Rimuovere il PBS dalla piastra multipozzetto. Aggiungere PBS fresco e lasciare riposare per un minuto. Rimuovere PBS e aggiungere il CS. Posizionare la piastra multipozzetto contenente il campione in un essiccatore e chiudere il coperchio.
Quindi avviare la pompa per vuoto per depressurizzare l'interno dell'essiccatore fino a meno 0,09 megapascal, lentamente. Dopo aver chiuso l'essiccatore a meno 0,09 megapascal, spegnere la pompa per vuoto e lasciarla riposare per un'ora a temperatura ambiente. Aprire leggermente l'essiccatore e riportarlo lentamente alla pressione atmosferica.
Versare acqua deionizzata nello spazio tra i pozzetti per evitare l'evaporazione del CS e conservare le piastre multi-pozzo a temperatura ambiente al buio per la pulizia. Quando il CS diventa verde, sostituirlo con una soluzione fresca. I campioni non tagliati sono rimasti verdi e non sono diventati trasparenti dopo tre mesi di trattamento con i campioni CS.In che sono stati staccati da tutte le foglie i nodi sono diventati bianchi dopo una settimana, anche se i nodi sono rimasti verdi.
Il campione non è diventato trasparente dopo quattro settimane. I campioni tagliati a mano sono diventati bianchi dopo una settimana di trattamento CS, ma non sono diventati trasparenti dopo quattro settimane. I campioni tagliati a 130 micrometri di spessore sono diventati traslucidi dopo una settimana di trattamento CS.
Il campione era quasi trasparente dopo due settimane. Nel nodo, la profondità osservabile dopo una settimana di trattamento CS era meno 60 micrometri e meno 90 micrometri dopo due settimane. I segnali fluorescenti sono stati osservati a una profondità di meno 80 micrometri a tre settimane e a una profondità di meno 100 micrometri a quattro settimane.
Nell'internodo, i segnali fluorescenti sono stati osservati a una profondità di meno 60 micrometri senza il trattamento CS. La profondità osservabile era di meno 90 micrometri dopo una settimana o tre settimane di trattamento CS e meno 100 micrometri dopo quattro settimane. Nelle foglie sono stati osservati segnali fluorescenti a una profondità di meno 90 micrometri senza trattamento CS, ma la luminosità era più debole rispetto ad altri tessuti.
Dopo una settimana, i segnali erano più luminosi e osservati a una profondità di meno 120 micrometri. L'espressione del fattore di trascrizione OS MASU 15 mOrange è stata osservata in giovani Pannocchia, foglia, nodo, internodo e fleurette. La chiave è trovare le migliori condizioni per le piante o i tessuti, ad esempio, periodo e pressione del vuoto, o posizione, e trattamento CS, tempistica, spessore, velocità e soluzione di colorazione appropriata.
La combinazione di temporizzazione e tecnologia di polimerizzazione consente l'osservazione temporale spaziale del modello di espressione genica e della comunicazione intercellulare in più tessuti di una singola sezione.
