La domanda chiave che questo metodo affronta è, se un ceppo di Chlamydomonas interessanti mantiene la capacità di comportamenti fotografici o meno. Questo metodo è semplice, veloce e facile da testare se un ceppo di interessanti esibisce comportamenti fotografici. Questo metodo può contribuire alla fotobiologia e alla biologia cellulare della motilità ciliare.
A dimostrare la procedura sarà Atsuko Isu, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio. Per iniziare, aggiungere da due a tre millilitri di sospensione cellulare in una capsula di Petri da 3,5 centimetri e posizionare il piatto su una scatola leggera. Agitare delicatamente il piatto per distribuire uniformemente le cellule e acquisire un'immagine prima dell'illuminazione.
Illuminare il piatto da un lato con un diodo o UN LED a emissione di luce verde in una stanza buia del desktop. Lasciare il piatto per circa cinque minuti prima di acquisire le immagini. Per il test di fototassi utilizzando goccioline di coltura cellulare, posizionare 25 microlitri di goccioline di sospensione cellulare direttamente su una piastra di plastica bianca utilizzando una micro pipetta.
Illumina le goccioline da un lato con un LED verde in una stanza buia del desktop e lasciale per tre minuti prima di acquisire le immagini. Posizionare 30 microlitri di sospensione cellulare su una slitta di vetro e posizionare uno slitta di copertura di 18 per 18 millimetri con distanziali sul lato. Illumina i campioni da un lato del coperchio senza un distanziatore con un LED verde e osserva le cellule al microscopio darkfield con una lente obiettivo 10X sotto scarsa luce rossa.
Dopo l'illuminazione della luce, registrare l'illuminazione cellulare per 20 secondi utilizzando un microscopio dotato di fotocamera. Per il test di risposta al fotoshock, posizionare 30 microlitri di sospensione cellulare su una diapositiva di vetro e posizionare uno slittamento di copertura con distanziali sulla parte superiore della diapositiva. Osservare la cellula al microscopio con luce rossa fioca.
Applicare l'illuminazione del flash utilizzando un flash della fotocamera durante la registrazione del movimento della cella. Un esempio rappresentativo di fototassi negativa in Chlamydomonas reinhardtii dopo cinque minuti di illuminazione laterale è mostrato qui. La maggior parte delle cellule si è accumulata sul lato opposto della sorgente luminosa.
Nel test di risposta al fotoshock, quasi tutte le cellule hanno mostrato la risposta al fotoshock. Le cellule nuotarono all'indietro per un breve periodo e si ripresero nuotando in avanti. Per eseguire questa procedura, utilizzare le cellule aridimigudolfasi ed esporle alla luce rossa prima del test.
Se non esposte alla luce rossa, le cellule diventeranno insensibili alla luce. Questa tecnica isola vari mutanti con fototassi anormale delle risposte al fotoshock. Inoltre, sono stati identificati vari fattori intracellulari ed extracellulari che influenzano i comportamenti fotografici.
