Il nuovo vaccino a nanoemulsione ha grandi vantaggi nella terapia tattica della malattia. Questi effetti impostati sono minimizzati da proprietà come il chopismo tumorale unico, l'identificazione di tattiche specifiche e la bassa tossicità sistemica. Prevediamo che il protocollo fornirà indizi tecnici e teorici per lo sviluppo futuro di nuovi vaccini per mucosa peptidica ectype delle cellule T.
Inizia mescolando un milligrammo di monofosforolo lipide A con 100 microlitri di DMSO. Vortice per cinque minuti e lasciarlo sciogliere per quattro ore a temperatura ambiente. Aggiungere quantitativamente TWEEN 80 e I-OVA.
Mescolare i componenti e aggiungere lo squalene. Quindi, aggiungere 100 microlitri di soluzione MPLA alla miscela preparata. Per preparare il vaccino nano emulsione, aggiungere la soluzione miscelata alle goccioline d'acqua a circa il 70% del volume totale e mescolare delicatamente per ottenere una miscela trasparente e facilmente scorrevole.
Per i test in vitro, iniziare con il risveglio delle cellule epiteliali BEAS2B. Accendere il bagno d'acqua e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius. Scongelare rapidamente le fiale di cellule congelate a bagnomaria, temperate a 37 gradi Celsius.
Dopo lo scongelamento, pipettare rapidamente le cellule in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri e aggiungere due millilitri del mezzo di crescita completo. Centrifugare il tubo a 129 G per cinque minuti. Rimuovere il supinatante e risospendere le cellule in due millilitri del mezzo di crescita completo.
Dopo aver centrifugato nuovamente le cellule, rimuovere il supinatante e aggiungere sei millilitri di terreno di crescita completo per risospendere le cellule. Quindi trasferire le cellule in un pallone di coltura T25 e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Una volta che la densità cellulare raggiunge l'80% al 90% scartare il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con due millilitri di PBS.
Aggiungere un millilitro di 0,25% tripsin per digerire le cellule per uno o due minuti. Quando si osserva l'arrotondamento delle cellule, aggiungere immediatamente quattro millilitri del mezzo di crescita completo per neutralizzare la tripsina. Mescolare e aspirare i campioni in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri.
Centrifugare i campioni a 129 G per cinque minuti. Rimuovere il supinante e risospendere le celle in un millilitro di mezzo completo RPMI 1640. Utilizzare 20 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule e diluire le cellule a una volta 10 alla quinta cella per millilitro.
Quindi placcare le celle BEAS2B ad una densità di una volta 10 alla quarta cella per pozzetto in 96 piastre di pozzetto in 100 microlitri di mezzo completo RPMI 1640 e pre-incubare le piastre per 24 ore come dimostrato in precedenza. Alla fine dell'incubazione, scartare il supinatante e aggiungere 100 microlitri di RPMI 1640 a ciascun pozzetto della piastra del pozzetto 96. Aggiungere 100 microlitri ciascuno di nano emulsione I-OVA, I-OVA miscelato con BNE e I-OVA pre-diluito con un mezzo di crescita completo a varie concentrazioni finali con BNE come controllo e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius.
Una volta completata l'incubazione, rimuovere il mezzo e trasferire la piastra in un luogo buio. Aggiungere 90 microlitri di terreno di coltura completo e 10 microlitri di soluzione CCK8 a ciascun pozzetto della piastra. Incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nanometri utilizzando un lettore di piastre marcato con enzimi. Utilizzare punte per pipette da 10 microlitri per eseguire l'immunizzazione nasale dei topi con I-OVA, I-OVA plus BNE e I-OVA NE per tre giorni. Utilizzare BNE e PBA come controllo sperimentale.
Successivamente, tagliare campioni spessi circa tre millimetri di tessuti nasali con le forbici e metterli in paraformaldeide al 4%. Rimuovere i tessuti polmonari e fissare i tessuti nasali e polmonari interi in paraformaldeide al 4% per 24 ore. TEM e AFM sono utilizzati per la valutazione delle caratteristiche di base del potenziale zeta superficiale e della dimensione delle particelle del nano vaccino.
Vengono mostrate le dimensioni delle particelle, gli indici di polidispersità, i potenziali zeta e la mobilità elettroforistica di I-OVA NE nelle analisi di stabilità dei musin. La vitalità relativa delle cellule BEAS2B è superiore all'80% nelle colture esposte a diverse concentrazioni peptidiche di I-OVA, BNE + I-OVA e I-OVA NE per 24 ore. Il gruppo I-OVA EN non ha avuto alcuna evidente tossicità mucosale, danno tissutale, sanguinamento o infiltrazione di cellule infiammatorie.
Le cellule epiteliali BEAS2B hanno catturato più FITC marcato I-OVA NE rispetto a quello della sua soluzione acquosa. L'effetto a rilascio prolungato di I-OVA NE in vitro è stato analizzato utilizzando il sistema IV-IS. Il vaccino I-OVA NE ha avuto un effetto a rilascio prolungato rispetto alla soluzione acquosa di I-OVA.
Nel gruppo I-OVA NE, il tempo percentuale di sopravvivenza è più alto rispetto ad altri gruppi e il volume del tumore era significativamente più piccolo, suggerendo che ha un migliore effetto di protezione preventiva rispetto agli altri gruppi. Nel modello terapeutico, il tempo mediano di sopravvivenza era significativamente diverso tra i diversi gruppi. Il volume tumorale del gruppo I-OVA NE era significativamente inferiore a quello del gruppo I-OVA.
Mescolare la miscela in modo uniforme è importante in questa procedura. Altrimenti ridurrà l'efficienza dei nanovaccini.
