Il protocollo consente la valutazione delle risposte dell'ospite a una varietà di agenti patogeni e formulazioni di vaccini. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la valutazione del carico batterico e delle risposte immunitarie in vivo, utilizzando un modello animale trattabile. A dimostrare questa procedura è Kacy Yount, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Per l'immunizzazione, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi in un topo anestetizzato di sei-dodici settimane e caricare una siringa per insulina da un millilitro, dotata di un ago calibro 28,5 con uno 0,1 millilitro del vaccino di interesse. Tenendo la siringa con un angolo di 45 gradi, con la smussatura rivolta verso l'alto, inserire l'ago di circa cinque millimetri nel deltoide del mouse e iniettare il vaccino. Tenere l'ago inserito nel muscolo per cinque o dieci secondi, quindi ruotare la siringa di 180 gradi, in modo che la smussatura sia rivolta verso il basso per creare un sigillo e per evitare perdite di vaccino, prima di ritrarre lentamente l'ago dal sito di iniezione.
Quindi riportare il topo nella sua gabbia, con monitoraggio, fino al pieno recupero. Circa due settimane dopo l'aumento, infettare i topi immunizzati. Afferrare un topo anestetizzato per la collottola del torace dorsale, dietro le scapole e il collo, e posizionare il mouse in posizione verticale per accedere al naso.
Utilizzando una punta di pipetta da 200 microlitri, applicare lentamente da 20 a 25 microlitri dell'inoculo batterico di interesse per ogni rullante dell'animale, tenendo il topo fino a quando l'intero inoculo non è stato inalato. Quindi fornire un volume uguale di PBS sterile a un gruppo di topi come controllo negativo. Nel punto finale sperimentale appropriato, posizionare un lato ventrale del topo infetto su una scheda di dissezione e fissare gli arti.
Bagnare il corpo con il 70% di etanolo e utilizzare le forcep per stringere la pelle sotto l'addome al centro del bacino. Usando forbici affilate, fai un taglio verticale fino alla mattiglia e seziona la pelle dalla parete peritoneale. Spostare la pelle ai lati della carcassa per creare un campo senza ostacoli per la raccolta sterile degli organi e afferrare il peritoneo intatto sotto la gabbia toracica, a o vicino al fegato.
Tagliare il peritoneo verso la gabbia toracica per esporre il tratto digestivo inferiore e spostare il colon a sinistra per rivelare la milza. Usando le forcelle curve, afferrare la milza e sezionare via il tessuto connettivo con le forbici. Quindi mettere la milza in un tubo conico da 15 millilitri contenente 3 millilitri di RPMI e il 5% di siero bovino fetale sul ghiaccio.
Utilizzate le forcep per stabilizzare la gabbia toracica nel processo xifoide e aprite il diaframma. I polmoni dovrebbero sgonfiarsi e cadere verso la colonna vertebrale. Tagliare la gabbia toracica ai lati per rimuovere la corazza e tagliare le arterie polmonari e le vene per isolare e rimuovere il lobo superiore del polmone destro.
Fissare il lobo in un tubo conico da 15 millilitri di formalina tamponata neutra al 10% a temperatura ambiente per almeno 24 ore e isolare i lobi rimanenti dei polmoni destro e sinistro. Quindi posizionare i lobi in un tubo conico da 15 millilitri, contenente due millilitri di caseina all'1% in PBS sul ghiaccio. Utilizzare un pipettaio da un millilitro con punta per raccogliere il sangue che riempie la cavità toracica e trasferire il sangue in un tubo microcentrifugo pre-etichettato da 1,5 millilitri sul ghiaccio.
Rimuovere le ghiandole parotidi, sublingui e submascellari e i linfonodi che coprono la trachea e aprire e rimuovere le membrane protettive che circondano la trachea. Usando forcelle e forbici fini, separare accuratamente la trachea dall'esofago e qualsiasi altro tessuto connettivo dalla parte superiore delle clavicola al fondo della mattiera. Usa le forcep per tenere la trachea e tagliare la trachea in cima alla clavicola.
Tirare giù la trachea per massimizzare l'elasticità, e tagliare la trachea nella parte inferiore della mattiera, proprio sopra la laringe, isolando circa un centimetro di tessuto. Quindi posizionare l'organo in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri preetichettato, contenente 0,3 millilitri di caseina all'1% in PBS su ghiaccio. Ora gira il mouse per un chiaro accesso al naso e spruzza la testa con il 70% di etanolo.
Afferrare manualmente l'animale direttamente dietro il cranio e utilizzare le forbici per tagliare la polpa morbida del muso, partendo dal fondo del naso e muovendosi verso l'alto. Rimuovere la pelliccia, la pelle e i baffi da tutto il naso e inserire le punte di un paio di forbici curve nei nares con le curve puntate verso il basso. Tagliare il passaggio nasale verso gli occhi, creando una formazione simile a un V.
Quindi utilizzare forcep fini per raccogliere il setto nasale e il tessuto molle all'interno della formazione e posizionare il tessuto in un tubo microcentrifugo preetichettato da 1,5 millilitri contenente 0,3 millilitri di caseina all'1% in PBS, sul ghiaccio. Per elaborare il tessuto polmonare, trasferire l'intero contenuto del tubo del campione polmonare in un omogeneizzatore sterile Dounce da 15 millilitri e utilizzare un pestello per omogeneizzare il tessuto. Dissociare il campione fino a quando non rimangono grandi particelle di tessuto e riportare la sospensione omogeneizzata al tubo originale da 15 millilitri.
Rimuovere un'aliquota di 0,3 millilitri per la placcatura delle unità di formazione della colonia e raccogliere il resto dell'omogeneato mediante centrifugazione. Aliquota 0,5 millilitri di supernatante in tubi microcentrifugi preetichettati per lo stoccaggio a 20 gradi Celsius fino all'analisi dell'espressione delle citochine da parte di Eliza. Quindi, diluire in serie le aliquote di 0,1 millilitri della sospensione polmonare omogeneizzata messa a riposo in 0,9 millilitri di PBS sterile per diluizione e utilizzare uno spargitore a triangolo sterile per placcare 0,1 millilitri di ogni diluizione scelta empiricamente su piastre preetichettate 10%Bordet-Gengou più streptomicina.
Qui vengono mostrate le misurazioni e i calcoli rappresentativi della densità ottica 600 per ottenere una sospensione batterica a densità ottica, per preparare un inoculo batterico diluito cento volte da consegnare ai topi. Dopo sette giorni di stimolazione dell'antigene vaccino, le cellule di milza immunizzate del gruppo vaccinale combinato producono gamma di interferone e IL17, mentre regolano significativamente il5, promuovendo un aiutante T, un aiutante T 17 polarizzazione della risposta immunitaria durante un'infezione da pertosse B. L'enumerazione dell'unità di formazione della colonia dei batteri recuperati dai problemi delle vie respiratorie di un topo infetto da pertosse B può essere utilizzata per valutare gli effetti protettivi del vaccino di interesse.
Lavorare nel modo più rapido ed efficiente possibile al fine di evitare la necrosi tissutale e conservare il tessuto isolato sul ghiaccio per preservare la vitalità dei batteri recuperati. La citometria del flusso ELISpot e l'isolamento del DNA e dell'RNA possono essere eseguiti per valutare le cellule immunitarie, la produzione di analiti e per consentire analisi epigenetiche e trascritomiche. Quando si lavora con agenti infettivi come la pertosse di Bordetella, è importante ricordare di indossare i DPI appropriati e lavorare in un armadio di biosicurezza certificato al fine di prevenire la trasmissione di agenti patogeni.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'enumerazione CFU dalle vie respiratorie, in particolare la faringe nasale. Per affrontare le domande nei campi del vaccino e delle malattie infettive sul targeting della colonizzazione batterica nel naso.
