Allo scopo di ridurre la sperimentazione animale e a causa della variabilità del test NH, l'OMS incoraggia a sviluppare approcci in vitro per valutare la potenza del vaccino antiracca. Questo test ELISA mostra una buona concordanza con un classico test NH nel riconoscere la forma immunogenica della glicoproteina, mostra un'alta sensibilità e può essere eseguito entro un solo giorno. La valutazione della potenza del vaccino antiracca in vitro da parte di ELISA è un'alternativa al test NH in vivo.
È promosso dai produttori e dai laboratori nazionali di controllo. È fondamentale distribuire volumi di pre-dimensioni in duplicato per ogni diluizione e asciugare bene la piastra su carta assorbente dopo i lavaggi per evitare di iniziare questa procedura, indossare adeguate attrezzature di protezione individuale tra cui cappotto usa e getta, guanti, maschera e occhiali. Trattare i materiali contaminati immergendoli in una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6% per 30 minuti per la decontaminazione.
Successivamente, impostare una piastra di immunoanalisi da 96 po 'e aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo monoclonale diluito nel tampone di carbonato ad ogni pozzo. Coprire la piastra con pellicola adesiva e incubare la micropiastra a 37 gradi Celsius per tre ore in un ambiente umidificato. Quindi aspirare e trasferire attentamente il contenuto di pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.
Invertire la micropiatta e lasciarla asciugare su carta assorbente a temperatura ambiente per cinque minuti. In primo luogo, aggiungere 300 microlitri del tampone di passivazione a ciascun pozzo. Coprire la piastra con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Successivamente, trasferire il contenuto del pozzo in uno contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Per lavare la piastra, aggiungere 300 microlitri del tampone di lavaggio ad ogni bene. Quindi aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.
Ripetere questo processo di lavaggio altre cinque volte per lavare ampiamente la piastra sensibilizzata. Successivamente, invertire la micropiatta e lasciarla asciugare su un pezzo di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto. Ricostituire il vaccino di riferimento in un millilitro di acqua distillata in modo tale che la concentrazione finale di glicoproteina del virus della rabbia sia di 10 microgrammi per millilitro.
Preparare una diluizione di 10 volte del vaccino di riferimento ricostituito nel diluente per raggiungere una concentrazione di glicoproteina del virus della rabbia di un microgrammo per millilitro. Successivamente, eseguire sei diluizioni seriali due volte di questo vaccino di riferimento nel diluente come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Distribuire 200 microlitri del diluente in pozzi duplicati per fungere da controllo cieco e 200 microlitri per pozzo per ogni diluizione vaccinale di riferimento in duplicato.
Quindi preparare una diluizione di 10 volte del vaccino testato nel diluente e preparare sette diluizioni seriali due volte del vaccino testato in diluente come delineato nella tabella due del protocollo di testo. Distribuire 200 microlitri di ogni diluizione vaccinale testata in duplice copia ad ogni pozzo della micropiastra. Coprire la micropiatta con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.
Dopo questo, rimuovere il film. Aspirare con cura e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,7%. Per lavare la piastra, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzo, aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%.
Ripetere il processo di lavaggio altre cinque volte per rimuovere l'antigene non legato e conservare i tritori di proteine G legati all'anticorpo rivestito. Invertire la micropiatta lavata e lasciarla asciugare su un pezzo di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto. Quindi distribuire 200 microlitri della diluizione raccomandata della perossidasi etichettata anticorpo monoclonale D1 in diluente ad ogni pozzo.
Coprire la micropiatta con pellicola adesiva e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, rimuovere il film, aspirare con attenzione e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente una soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Per lavare la micropiatta, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzo.
Aspirare con cura e trasferire il contenuto di ogni pozzo in un recipiente contenente soluzione di ipoclorito di sodio al 2,6%. Ripetere questo processo di lavaggio altre cinque volte per rimuovere l'anticorpo etichettato perossidasi non legato. Invertire la micropiatta lavata e lasciarla asciugare su un pezzo di carta assorbente a temperatura ambiente per un minuto.
Successivamente, distribuire 200 microlitri di soluzione substrato-cromogeno in ogni pozzo. Sigillare la micropiatta con pellicola e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto in ogni pozzo per fermare la reazione.
Pulire con cura il fondo della micropiatta e posizionarlo nello spettrofotometro. Determinare la densità ottica a 492 nanometri per tutti i pozzi utilizzati. Raccogliere questi dati in un file di foglio di calcolo per l'analisi.
Successivamente, create grafici sia per la curva del vaccino di riferimento che per i valori di densità ottica delineati nel protocollo di testo. In questo studio, il test ELISA in vitro viene utilizzato per valutare la potenza del vaccino antiracca. Qui vengono mostrati i valori rappresentativi della densità ottica di un esperimento tipico.
Questi valori sono utilizzati per disegnare la curva del vaccino di riferimento tracciando la densità ottica media per le diverse diluizioni del vaccino di riferimento sull'asse verticale e la concentrazione della glicoproteina sull'asse orizzontale. Il contenuto di glicoproteina del vaccino testato viene quindi stimato utilizzando questa curva. La valutazione è precisa per le diluizioni che hanno un valore medio di densità ottica nell'area del rivestimento della curva del vaccino di riferimento.
Tenendo conto della diluizione di uno a 40, la proiezione verticale di OD 1534 sull'asse x corrisponde a 500 nanogrammi per millilitro. Quindi il vaccino testato è stimato in 20 microgrammi per millilitro di glicoproteina. Quando viene stabilita la potenza in vitro, è necessario confrontare il vaccino testato con il riferimento a sei standard internazionali dell'OMS calibrati in unità internazionali.
Lo stesso metodo può essere utilizzato con altri anticorpi per ingrandire il rilevamento di più ceppi di vaccini, compresi quelli utilizzati nei vaccini veterinari che sono classicamente più variabili. Gli anticorpi possono anche essere utilizzati in competizione per la titolazione di anticorpi antirabi nel siero equino o umano. Devono essere prese precauzioni con vaccini non inattivati o con virus.
Assicurati di utilizzare dispositivi di protezione individuale, indossare guanti e decontaminare tutto correttamente. Inoltre, fai attenzione con compresse di come sono cancerogene e con la soluzione acida di ipoclorito di sodio.
