La strategia per escludere i neuroni utilizzando lo smistamento FACS negativo genera tassi di sequenziamento dell'RNA di alta qualità della popolazione cellulare a bassa abbondanza, come cellule staminali neurali, astrociti e oligodendrociti, per studiare il loro ruolo nella modulazione della neurogenesi ippocampale adulta. Con questo metodo, è possibile adattare la scelta dell'anticorpo nel GATING FACS, il che rende questo protocollo molto versatile nell'affrontare varie questioni biologiche relative al giro dentato. Questo metodo è progettato principalmente per studiare la nicchia dell'ippocampo adulto.
Tuttavia, potrebbe essere facilmente adattato per lo studio di altre nicchie di cellule staminali. A dimostrare la procedura sarà Sara Ahmed de Prado, borsista di formazione post-dottorato presso il Francis Crick Institute. Per iniziare, trasferisci il cervello sezionato dal topo eutanasia in una capsula di Petri di 10 centimetri piena di PBS ghiacciato.
Quindi posizionare la capsula di Petri sul ghiaccio e tagliare il cervello in due metà lungo l'asse sagittale. Usando un bisturi, rimuovere il cervelletto. Trasferire una metà del cervello nella nuova capsula di Petri di 10 centimetri posta sul ghiaccio, contenente PBS ghiacciato.
Sezionare il giro dentato, o DG, usando il binocolo, e ripetere questo passaggio per ottenere il secondo DG dalla seconda metà del cervello. Trasferire i due DG nell'omogeneizzatore Dounce pre-raffreddato e aggiungere 1 millilitro di tampone di omogeneizzazione a freddo, o HB. Omogeneizzare il tessuto con 10 colpi del pestello A sciolto, seguito da 15 colpi del pestello B stretto. Trasferire l'omogenato in un tubo prerefrigerato da 15 millilitri.
Risciacquare l'omogeneizzatore Dounce con 1 millilitro di HB freddo e combinarlo con lo stesso tubo. Aggiungere 3 millilitri di HB al tubo da 15 millilitri e incubare per 5 minuti su ghiaccio. Mescolare questa sospensione di nuclei due volte invertendo delicatamente il tubo.
Utilizzando 0,5 millilitri di HB, pre-bagnare il tappo del filtro da 70 micrometri posto su una provetta da 50 millilitri, quindi filtrare la sospensione dei nuclei prima di lavare il filtro cellulare con 0,5 millilitri di HB. Quindi, rimuovere il filtro cellulare e centrifugare la provetta in una centrifuga a secchio oscillante a 500 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante. Risospendere delicatamente il pellet in 4 millilitri di HB utilizzando una pipetta P1000.
Dopo 5 minuti di incubazione su ghiaccio, centrifugare la sospensione a 500 x g per 10 minuti, a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 millilitri di mezzi di lavaggio. Utilizzare 0,5 millilitri di mezzo di lavaggio per pre-bagnare un tappo filtrante da 35 micrometri su una provetta da 50 millilitri.
Quindi filtrare la sospensione dei nuclei pipettando 0,5 millilitri di sospensione alla volta, utilizzando una pipetta P1000. Dopo aver lavato il tappo del filtro con 0,5 millilitri di mezzo di lavaggio, posizionare il tubo sul ghiaccio. Trasferire il filtrato in un nuovo tubo da 15 millilitri e centrifugarlo per 5 minuti e 4 gradi Celsius, a 500 x g.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 millilitri di mezzi di lavaggio. Ripetere la centrifugazione e risospendere il pellet in 1 millilitro di mezzo di lavaggio con il mouse anti-NeuN, Alexa Fluor 488-coniugato anticorpo e 1 microgrammo per millilitro DAPI. Incubare la reazione per 45 minuti sul ghiaccio al buio.
Per la selezione dei nuclei attivati a fluorescenza, o FANS, trasferire la sospensione di nuclei immuno-colorati in una provetta da 5 millilitri e posizionarla sul ghiaccio fino all'inizio della procedura di citometria a flusso. Vortice i campioni per 3 secondi, con intensità lieve, prima di posizionare i tubi nello strumento FACS. Per acquisire i dati dalla sospensione di nuclei colorati, impostare le porte in altezza DAPI e l'area DAPI per escludere i detriti cellulari e i nuclei aggregati.
Quindi impostare le porte nell'area di dispersione lato log, o SSC, e nell'area di dispersione in avanti del registro, o FSC, per separare i singoli nuclei dai residui di aggregati o detriti cellulari colorati DAPI. Quindi isolare la popolazione NeuN-AF488-negativa impostando le porte per l'area anti-NeuN-AF488 e FSC. Dopo l'analisi, ordinare la popolazione negativa anti-NeuN-AF488 in un tubo di raccolta da 1,5 millilitri riempito con 50 microlitri di mezzi di lavaggio utilizzando la strategia di gating.
Una volta effettuata la selezione, aggiungere 1 millilitro di PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina, o BSA, al tubo di raccolta per raccogliere le goccioline dalla parete del tubo e centrifugare il tubo a 500 x g, per 5 minuti, a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante, lasciando 50 microlitri di soluto per risospendere i nuclei centrifugati. In un microtubo da 0,5 millilitri, aggiungere 5 microlitri della sospensione dei nuclei a 5 microlitri di blu Trypan.
Misurare la concentrazione e valutare la vitalità della sospensione a singola cellula utilizzando un contatore automatico di celle prima di eseguire la preparazione della libreria e il sequenziamento dei nuclei. Il clustering bioinformatico ha rivelato gruppi ben separati di nuclei corrispondenti a tipi cellulari noti all'interno della DG, con o senza FANS. All'interno del campione non classificato FACS, la maggior parte dei nuclei sequenziati di alta qualità erano l'84,9% dei neuroni.
Comprendeva tre gruppi di neuroni, indicando la possibilità che le popolazioni cellulari più rappresentative nel giro dentato fossero neuroni granuli, altri neuroni eccitatori e neuroni inibitori. All'interno del campione non classificato FACS, i cluster non neuronali identificati erano per lo più costituiti dall'11,1% dei tipi di cellule gliali, inclusi astrociti, oligodendrociti e cellule precursori degli oligodendrociti, 3,3% cellule immunitarie e 0, 6% cellule Cajal-Retzius. Durante l'esecuzione di FANS per escludere le popolazioni NeuN positive, i cluster di cellule gliali sono diventati prominenti, con l'81,3% dei nuclei totali.
Per i campioni sequenziati a 50.000 letture per nucleo, sono stati rilevati 25.010 geni per nucleo per il campione non classificato FACS e 1.665,5 geni per il campione FANS NeuN-negativo, confermando il profilo trascrittomico di alta qualità dei singoli nuclei e l'ordinamento FACS non danneggia i nuclei per il successivo snRNA-seq. L'alta percentuale di neuroni nel campione non classificato FACS aveva un'attività trascrizionale più elevata di 2.660 geni per nucleo e 6.170 trascritti per nucleo nel campione non classificato FACS rispetto ai tipi di cellule non neuronali con attività trascrizionale media di 1.090 geni per nucleo e 1.785 trascritti per nucleo. Una volta che i dati sono stati generati con questo protocollo, vale la pena considerare questi nuovi metodi ortogonali come sintomatici speciali o studi in vivo per convalidare eventuali risultati.
