Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è un potente strumento per studiare i profili trascrittivi delle cellule, in particolare nel tessuto eterogeneo, come il sistema nervoso centrale. Questo protocollo fornisce un metodo per isolare i nuclei per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Usando nuclei al posto delle cellule, questo metodo può essere applicato a tessuti difficili da dissociare, così come ai tessuti congelati.
Inoltre, questo metodo può essere applicato allo studio di cambiamenti specifici del tipo di cellula nelle cellule a seguito di malattia o lesione. Iniziare questa procedura con l'eutanasia del mouse, come descritto nel protocollo di testo. Successivamente, fai un'incisione lungo la lunghezza del corpo per esporre gli organi interni.
Eviscerare il topo tirando gli organi interni dalla cavità corporea usando le forcep. Non utilizzare tovaglioli di carta per pulire l'area o rimuovere organi, in quanto ciò potrebbe introdurre contaminanti. Usando le forbici, tagliare la colonna vertebrale tra le vertebre spinali L2 e L3.
Per espellere il midollo spinale, montare una siringa da tre millilitri contenente PBS ghiacciato con un ago da 1/4 di pollice calibro 25. Posizionare la punta dell'ago nell'estremità sacrale della colonna vertebrale. Utilizzare due dita per pizzicare le vertebre per creare una tenuta stretta intorno alla punta dell'ago e premere verso il basso sullo stantuffo per espellere il midollo spinale rostralmente.
Posizionare il midollo spinale in una piastra di Petri con PBS ghiacciato. Se è richiesta solo la porzione lombare del cordone ombelicale, tagliare le porzioni sacrali e toraciche del midollo spinale. A questo punto, congelare il tessuto e conservare a meno 80 gradi Celsius, o utilizzare immediatamente per la lisi cellulare meccanica del detergente come descritto qui, o lisi meccanica ipotonica come descritto nel protocollo di testo.
Per determinare la lisi cellulare meccanica del detergente, posizionare il midollo spinale lombare in un omogeneizzatore Dounce pre-refrigerato e aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi detergente prerimorto. Dounce con cinque tratti del pestello sciolto, A, e poi da cinque a 10 colpi del pestello stretto, B.Evitare di sollevare l'omogeneizzatore al di fuori della soluzione di lisi tra un tratto e l'altro ed evitare di introdurre bolle. Ora, posizionare un colino da 40 micron su un tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri e pre-bagnato con un millilitro di tampone di saccarosio basso.
Aggiungere un millilitro di tampone di saccarosio basso all'omogeneizzatore Dounce contenente i nuclei grezzi nel tampone di lisi e mescolare delicatamente pipettando da due a tre volte. Passare i nuclei grezzi prep sopra il colino da 40 micron, nel tubo conico pre-refrigerato da 50 millilitri. Passare un ulteriore tampone di saccarosio basso di un millilitro sul colino da 40 micron, portando il volume finale a tre millilitri del tampone di saccarosio basso e a 500 microlitri del tampone di lysis.
Ripetere questi passaggi se si combinano più cavi, raffreddando nello stesso tubo conico. Quindi, centrifugare il campione a 3200 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Una volta completata la centrifugazione, decantare il supernatante.
Sospendiamo la tavolozza usando tre millilitri di tampone di saccarosio basso. Ruotare delicatamente per rimuovere il pellet dalla parete per facilitare la sospensione. Dopo aver lasciato riposare il campione sul ghiaccio per due minuti, trasferire la sospensione su un tubo Oak Ridge.
Utilizzando l'omogeneizzatore all'impostazione di uno, omogeneizzare i nuclei in tampone di saccarosio basso per 15-30 secondi, mantenendo il campione sul ghiaccio. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per stratificazione di 12,5 millilitri di tampone di saccarosio a densità, sotto l'omogeneato tampone di saccarosio basso, facendo attenzione a non creare una bolla che interrompa gli strati di densità. Centrifugare i tubi a 3200 volte G, per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Una volta completata la centrifugazione, decantare immediatamente il supernatante in un movimento di sfarfallio. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere immediatamente il tubo oak ridge dalla centrifuga e decantare rapidamente il supernatante. Utilizzando 100 microlitri per un millilitro di soluzione di resuspensione, sospendiamo i nuclei rimanenti sulla parete.
Evitare il cipiglio di mielina che rimane con la preparazione a base di detergente. La mancata zione rapida di questi passaggi può comportare una preparazione dei nuclei con detriti cellulari in eccesso, o mielina, che può impedire il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo a valle. Filtrare i nuclei attraverso un colino di dimensioni dei pori da 30 a 35 micron e raccogliere in un tubo pre-refrigerato.
Determinare la resa dei nuclei, usando un emocitometro per contare i nuclei sotto un obiettivo 10 x, prima di procedere al sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo, come descritto nel protocollo di testo. Il campo luminoso e le immagini epifluorescenti dei nuclei, isolati utilizzando il protocollo di lisi meccanica del detergente, sono mostrate a 10 x. Questi nuclei sono isolati in modo imparziale, consentendo lo studio dei profili di espressione genica endogena a livello di una singola cellula.
Mostrato qui, è un grafico tSNE rappresentativo del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo, da un midollo spinale lombare del topo, usando una piattaforma di incapsulamento delle goccioline massicciamente parallela. I nuclei isolati dal tessuto fresco o congelato possono essere utilizzati per il sequenziamento su piattaforme commerciali e accademiche. Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i profili trascrittivi a livello di singola cellula, utilizzando tessuti difficili da dissociare, come il midollo spinale, o anche il tessuto congelato, come il materiale biobancario.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ridurre la quantità di tempo tra eutanasia elisi cellulare. Inoltre, è importante ridurre al minimo le bolle introdotte nelle soluzioni dalla lisi cellulare alla resopensione e acquistare nuclei animali domestici con cura. Seguendo questa procedura, i nuclei possono essere utilizzati per applicazioni alternative, come lo smistamento dei facs, al fine di isolare tipi di cellule specifici.
