Vorremmo ringraziare Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann per un&#39;eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo W. Macklin per la fornitura di Plp-GFP topi. TM è sostenuto dall&#39;Istituto di Studi Avanzati (Technische Universität München), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), dalla Alexander-von-Humboldt-Foundation e dall&#39;agenzia finanziamenti nazionali (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) nell&#39;ambito di ERA-Net neurone &quot;iPSoALS&quot; e &quot;2-fotoni di imaging&quot;. TM e MB sono supportati dal Centro per la Scienza Protein integrata (Monaco di Baviera). PM è stato sostenuto dalla Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni Espianto (Figura 1) Timing: 15 min. <ol><li> Preparare gli strumenti chirurgici: 2 paia di pinze, 1 paio di forbici, 1 paio di forbici a molla, 1 piatto coltura tissutale (10 cm). Pre-bolle (minimo per 15 min) raffreddato (4 ° C), soluzione di Ringer con il 5% di CO 2/95% O 2. Fill 15 cm piatto di coltura di tessuti con ghiaccio e coprire con piastra metallica. Preparare microscopio dissezione e posizionare il piatto di 15-cm con ghiaccio sotto la portata dissezione per raffreddare l&#39;espianto durante la dissezione. </li><li> Letalmente anestetizzare il mouse per overdose isoflurano (o qualsiasi altro metodo approvato di sacrificio). Spruzzare il mouse con etanolo al 70% per evitare la contaminazione del pelo espianto. Per SC candeggio, abbiamo usato Plp-GFP topi, che possono essere attraversati a Thy1-OFP3 o Thy1-Membow13 per la visualizzazione simultanea del assone. </li><li> Utilizzando la coppia di forbici grandi, fare una incisione mediana dila pelle sopra lo sterno e due incisioni parallele al bordo inferiore della gabbia toracica. </li><li> Utilizzando il paio di forbici grandi, togliere la pelle, aprire la parete addominale, e fare incisioni parallele alla gabbia toracica tutta la strada fino alla colonna vertebrale. Poi sezionare fuori i muscoli pettorali facendo incisioni vicino all&#39;inserzione muscolo sterno. </li><li> Tagliare il diaframma aperto appena sotto la cartilagine xifoide e sezionare fuori la membrana lungo i suoi inserimenti costiere. </li><li> Con la gabbia toracica dal processo xifoideo con una serie di pinze, iniziare a tagliare le nervature largo della colonna vertebrale, il più vicino possibile alle loro inserimenti. I tagli sinistro e destro dovrebbero convergere sopra il cuore verso il manubrio sterni. Cercate di evitare di tagliare i vasi sanguigni principali (in particolare le vene succlavia). Migliore visibilità si ottiene sollevando delicatamente la preparazione mentre si tiene sul processo xifoideo con una pinza. </li><li> Eseguire un taglio trasversale appena sotto il manubrio sternie trasferire il espianto nel 10 cm piatto con raffreddato CO 5% 2/95% O 2-gorgogliare Ringer soluzione. Posizionare il 10-cm piatto sulla piastra metallica che copre il 15-cm piatto di coltura di tessuti pieno di ghiaccio. Tutte le ulteriori misure deve essere effettuato sotto il microscopio dissezione. </li><li> Usando le forbici a molla piccole rimuovere i resti di timo, pleura, membrana (interno) e dei muscoli pettorali (al di fuori, la figura 1B-D). </li><li> Per adattare l&#39;espianto al 3,5 cm piatto, sezionare fuori tutte le costole che non inseriscono allo sterno. Questo è fatto meglio con le forbici a molla piccole e tagliare il tessuto tra le costole (Figura 1E). </li><li> Pin il triangularis sterni nervo-muscolo espianto nel Sylgard rivestito 3,5 cm piatto di coltura utilizzando perni minutien (ridotto a &lt;4 mm; Figura 1G). Due perni dovrebbe passare attraverso cartilaginei (bianco) parti dello sterno. Inserire almeno due perni attraverso le nervature sia sul lato destro e sinistro di thespianto e puntando le parti più molli cartilaginei e evitando le costole sotto o vicino al muscolo triangularis. I perni vengono utilizzati più, tanto meglio (si utilizzano in genere 8-10). Come definire con precisione la preparazione, fare in modo che le costole sono alquanto diffuse, che fissa il muscolo in una posizione leggermente allungato. </li><li> Opzionale: Visualizza siti sinaptici contengono recettori con l&#39;aggiunta di coloranti bungarotossina accoppiato ad Alexa (concentrazione di 0,8 mg / ml in 5% di CO 2/95% O 2-gorgogliare Ringer soluzione). Incubare espianto bloccato in Sylgard piatto rivestito per 15-20 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare più volte con il 5% di CO 2/95% O 2-gorgogliare Ringer soluzione. </li></ol> 2. SC sbianca e opzionale microscopia time-lapse (Figura 2) Timing: 30 - 45 min + opzionale 1-5 ore per il lasso di tempo. <ol><li> Transfer 3,5 cm Sylgard rivestito piatto per uno spirito microscopio confocale dotatoh un laser ad argon (488 nm) e gli obiettivi di immersione in acqua (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA e 100x, 1.0 NA o 60x, 0.9 NA). </li><li> Opzionale per time-lapse microscopia: Insert 3,5 cm Sylgard rivestito piatto in anello di riscaldamento, installare il sistema superfusione e sonda di temperatura (Figura 2A). Assicurarsi che nessuna di esse toccano l&#39;espianto, il bordo del piatto o il rivestimento Sylgard. Riscaldare il campione a 33-35 ° C. Per SC sbiancamento senza time-lapse, temperatura ambiente è meglio, come le cellule mostrano una dinamica inferiore tra passi sbiancamento. </li><li> Con un obiettivo 4x aria osservare modello innervazione del muscolo triangularis sterni e trovare triangularis banda endplate sterni. Passa a 20x immersione-cone obiettivo e iniziare la ricerca per le regioni superficiali all&#39;interno della banda di placca motrice (costole sovrastanti aree sono buoni candidati). Cambiare obiettivo di 100x o 60x immersione cono obiettivo di controllare NMJs individuali. Ideale è un NMJ che è coperto da SC diverse e si trova molto superficially (Figura 2B). Se si esegue time-lapse imaging dopo lo sbiancamento, selezionare fino a 3 NMJs che sono relativamente vicine tra di loro per aumentare il rendimento. </li><li> Acquisire una immagine confocale del NMJ prima fotometabolismo SCs individuali (Figura 2B). (Per l&#39;imaging piena risoluzione, ad esempio su un microscopio Olympus FV1000, utilizzare un 100x, 1,0 e 2,5 NA obiettivo zoom, che si traduce in Nyquist-limitata campionamento di ~ 0,1 micron per pixel.) </li><li> &quot;Park&quot; del fascio laser 488 nm centralmente sul nucleo di una SC con potenza massima per 5 secondi (in alternativa un modello di scansione efficiente in una piccola regione di interesse può essere usato, come il &quot;tornado Scan&quot; su un microscopio Olympus; come si usa un microscopio confocale, il laser viene focalizzato in immagine-coniugati piani e quindi, a 488 nm, con un obiettivo di 1,0 NA, &lt;0,5 mm di diametro). Nuovamente concentrarsi sulla cella e giudice sbiancamento risultato. Se necessario ripetere lo sbiancamento passo di nuovo fino a quando i livelli di GFP sono ridurred per quasi sfondo livelli. Acquisire un&#39;immagine dopo sbianca (Figura 2C). È importante assicurarsi che la regione sbiancato è fuori di sovrapposizione tra due celle - se vi è sovrapposizione, sbiancamento in una seconda cella sarà evidente. </li><li> Ripetere il passaggio precedente finché tutti tranne uno SC sono sbiancati (Figura 2D-E). L&#39;ultimo &quot;greggi&quot; SC è adatto per confocale microscopia time-lapse. Ricostruire singole cellule per sottrazione di immagini, ad esempio utilizzando il software Photoshop, a delineare la morfologia singolo SC e territorio (Figura 2F). Essere consapevoli del fatto che la sottrazione di due maghi ulteriore fattore di disturbo (ad esempio mediante l&#39;importazione in consecutivi &quot;strati&quot; in Photoshop e quindi impostando il canale superiore per &quot;differenza&quot; nel menu a discesa nella parte superiore della scheda canali). Questo può essere aggirato utilizzando la funzione &quot;Antipolvere&quot; sui canali prima di sottrarre e il ritaglio via qualsiasi sfondo che, ovviamente, non ha origine dalcella sbiancato. Per ottimizzare il contrasto, può essere necessario regolare la luminosità dei due canali nella finestra &quot;livelli&quot;. L&#39;immagine risultante della cella sbiancato è sovrapposto l&#39;immagine originale di una sinapsi, pseudo-colore in una tonalità unica e reso trasparente per colorare il territorio della cella sbiancato nell&#39;immagine originale (dal fare questo per tutte sbiancato e l&#39;ultimo , le cellule greggi l&#39;immagine mostrata in figura risultati 2F). </li><li> Optional: Start confocale time-lapse microscopia dopo lo sbiancamento tutti tranne uno SC. Prendete un&#39;immagine ad intervalli fissi (per esempio ogni 5 a 10 min). Uso come potenza laser meno possibile. Fino a 3 NMJs possono essere esposte alla stessa sessione. </li><li> Fare una mappa delle e ritardi NMJs prendendo una immagine a 100x senza zoom, quindi immagini della regione con 20x e obiettivi 4x (Figura 2G-I). Questa &quot;mappa&quot; è necessario per trovare NMJs seguito immunoistochimica di un muscolo fissa. </li><li> Per immaginielaborazione, convertire le immagini in singole proiezioni di massima intensità e salvare in formato tiff. Combinare tutti gli z-proiettate time-point in una pila e allineare in xy, per esempio usando il plugin &quot;stackreg&quot; 10 nelle isole Figi (un pacchetto basato sul software open source ImageJ, National Institutes of Health). </li></ol> 3. Fissazione e immunoistochimica (Figura 3) Timing: Pernottamento. <ol><li> Trasferire l&#39;espianto in un 50-ml tubo di reazione contenente almeno 15 ml 4% PFA rimuovendo con cura i perni. Post-fissare la parete toracica anteriore contenente il muscolo triangularis sterni per 1 ora su ghiaccio. Risciacquare tessuto fissato con 0,1 M glicina in PBS (per estinguere fissativo residuo e quindi ridurre background) per almeno 10 min. I campioni possono essere conservati a questo punto ed elaborare successivamente. </li><li> Trasferimento espianto fissa a una parabola di 10 cm tessuto rivestito cultura Sylgard pieno di 0,01 M PBS. Tagliare una forma trapezoidale con un SIde parallelo allo sterno e l&#39;altro attraverso i osso-cartilagine transizioni - questo contiene il muscolo triangularis sulla sua superficie. Rimuovere costole inferiori con una orizzontale (trans-sternale) tagliate in modo che l&#39;estremità caudale del muscolo triangularis sono liberamente accessibili (Figura 3A-D). </li><li> Inserire un ago ipodermico come perno nella parte superiore del trapezio (Figura 3E). Utilizzare un ago ipodermico attaccato ad una siringa da 1 ml e pinze per rimuovere il muscolo triangularis sulla superficie delicatamente trattenendo un angolo caudale del muscolo e utilizzando l&#39;ago come un micro-bisturi. Assicurarsi che i tagli sono fatti parallelo al piano della parete toracica. Una volta che la parte caudale del muscolo viene rilasciato, inserire un altro ago ipodermico come un perno sotto il muscolo attraverso la parete toracica - questo immobilizza la preparazione e consente di esercitare una leggera trazione sul muscolo con pinze (Figura 3F). Come si sta tagliando pap connettiviinserzioni ue, &quot;pelare&quot; via il muscolo dal torace. Tagliare ultimo attacco caudale con le forbici a molla. Rimuovere residui di grasso e di sangue dei vasi con una pinzetta. Fare attenzione a non strappare i nervi. Nota: Utilizzare gruppi separati di strumenti e piatti per lavorare con il tessuto vivo e fissa. </li><li> Avviare immunoistochimica (utilizzando un protocollo standard) trasferendo campioni di tessuto in una soluzione bloccante per 1 ora su un agitatore a temperatura ambiente. Più piccolo volume possibile per la colorazione è di 200 microlitri utilizzando una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Applicare l&#39;anticorpo primario diluito in una soluzione bloccante, 200 pl per pozzetto, overnight a 4 ° C su un agitatore. </li><li> Lavare in 0,01 M PBS tre volte per 10 min. </li><li> Applicare adatto anticorpo secondario per 1-2 ore a temperatura ambiente, diluito in soluzione di blocco. </li><li> Lavare in 0,01 M PBS tre volte per 10 min. </li><li> Montare in anti-fading medio (ad es Vectashield) e applicare il coprioggetto. </li><li> Disporre il vetrino sul piatto di metallo magnetico, magnete posto in cimadel campione per appiattire per alcune ore o durante la notte a 4 ° C. Sigillare con lo smalto. </li></ol>

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo SC sbiancamento qui presentato è semplice, veloce e versatile: (i) Permette rivelando singola SC morfologia e dinamiche mediante microscopia confocale basato su un singolo transgene - che è un vantaggio significativo quando si associa l&#39;es approccio con modelli di malattia che richiedono alleli aggiuntivi . (Ii) Il metodo è veloce, come da dissezione del fissaggio può essere eseguito in mezza giornata. (Iii) Il numero di applicazioni è ampio, in quanto può essere combinato con altri metodi, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda (esempio) </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Soluzione di etanolo al 70% (vol / vol) </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> in flacone spray </td></tr><tr><td> isoflurano </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> qualsiasi altro approvato anestetico può essere utilizzato per l&#39;anestesia letale </td></tr><tr><td> topi transgenici (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> essere ottenute da fonti citate </td></tr><tr><td> microscopio dissezione a freddo, luce di illuminazione </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> dotato Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> pinza #2 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> pinze # 5 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> forbici, grandi medici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> forbici, piccolo primavera angolato </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> in linea riscaldatore </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> riscaldamento ad anello per 3.5 cm di piatti </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> due canali temperatura del sistema di controllo </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusione pompa sistema </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15 cm tessuto piatto di coltura </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> riempito con ghiaccio e coperto da lamiera </td></tr><tr><td> 10 cm tessuto piatto di coltura </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> con soluzione Ringer ossigenato di </td></tr><tr><td> 3,5 cm tessuto piatto di coltura </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> riempito con Sylgard polimero </td></tr><tr><td> Sylgard polimero </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Kit di silicone elastomero </td><td></td></tr><tr><td> microscopio confocale </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td><td> con argon laser </td></tr><tr><td> 50 ml provettone </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% in PBS PFA </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> cannula 0,5 millimetri x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> siringa da 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> sinaptofisina anticorpo </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> coniglio </td></tr><tr><td> anticorpo secondario </td><td> Invitrogen </td><td> A-11.012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glicina in PBS </td><td> Roth </td><td> 3.790,1 </td><td></td></tr><tr><td> coprioggetti </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositive </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector laboratori </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> perni minutien × 10 </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-20 </td><td> abbreviato &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-bungarotossina accoppiato ad Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blocking Solution </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3.051,3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% di siero di capra </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% di albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ringer gorgogliare con il 95% O 2/5% di CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mm NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mm NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM di glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Sequenziale foto-sbiancamento fornisce un modo non invasivo per etichettare i singoli CS al NMJ. Il NMJ è il più grande sinapsi del sistema nervoso dei mammiferi ed è servito da guida modello per studiare la struttura e la funzione sinaptica. Nel topo NMJs terminali motore assoni formano pretzel-come siti di contatto con le fibre muscolari. L&#39;assone motore e il terminale sono rivestiti da SCS. Negli ultimi decenni, diversi topi transgenici sono stati generati per visualizzare i motoneuroni e SCS, per esempio Thy1-XFP 1 e Plp-GFP topi 2, rispettivamente. Lungo assoni motori, mielinizzanti SC assoni sono disposti in internodi non sovrapposte, separate da nodi di Ranvier, per consentire saltatoria propagazione del potenziale d&#39;azione. Al contrario, CS terminali a sinapsi sono specializzate cellule gliali, che monitorano e promuovere la neurotrasmissione, digerire detriti e guida assoni rigeneranti. NMJs sono strettamente coperti fino a una mezza dozzina di non MYELinating SCs terminali - questi, però, non può essere risolto singolarmente al microscopio ottico, in quanto sono in contatto diretto membrana 3. Esistono diversi approcci per visualizzare singolarmente SC terminale. Nessuno di questi è impeccabile, però. Per esempio, il riempimento colorante, dove sono impalato singole cellule con un colorante pieno microelettrodo, richiede la distruzione di una cellula marcato prima di occupare un secondo. Questo non è compatibile con le successive registrazioni time-lapse 3. Multispettrale etichettatura &quot;Brainbow&quot; di SCS è stato ottenuto utilizzando l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti combinatorio 4. Tuttavia, questa tecnica richiede che unisce transgeni diversi ed è limitato dal pattern di espressione dei promotori utilizzati. In futuro, espressione di &quot;foto-commutabili&quot; proteine ​​CS potrebbe essere ancora un&#39;altra alternativa 5. Qui vi presentiamo in sequenza foto-sbiancamento, in cui le cellule singole sono sbiancati, e la loro immagine ottenuta per sottrazione. Noi crediamoche questo approccio - per la facilità e versatilità - rappresenta un&#39;aggiunta duratura palette tecnologia del neuroscienziato, soprattutto in quanto può essere utilizzato in vivo e trasferito altri tipi cellulari, siti anatomici o specie 6. Nel seguente protocollo, abbiamo dettaglio l&#39;applicazione sequenziale di sbiancamento e successiva confocale time-lapse microscopia a CS terminali in triangularis espianti muscolari Sterni. Questo sottile, superficiale e facilmente sezionato nervo-muscolo preparazione 7,8 si è dimostrato utile per lo studio di NMJ sviluppo, fisiologia e patologia 9. Infine, viene spiegato come il muscolo triangularis sterni è disposta dopo la fissazione per eseguire correlata ad alta risoluzione imaging confocale, immunoistochimica o esami ultrastrutturali.

Un esempio di un espianto triangularis sterni piatto pronto per l&#39;imaging è mostrato in Figura 1G. Questo espianto è particolarmente adatto per l&#39;imaging NMJs ex vivo come il muscolo triangularis consiste solo di pochi strati di fibre muscolari. Ciò permette di ottenere immagini ad alta risoluzione da espianti derivati ​​da linee di topi transgenici che evidenziano sia SCS (Plp-GFP 2) e / o (assoni Thy1 XFP-1). Fattori critici per l&#39;ima...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualizzare le singole celle di densamente tessuti confezionati, come le cellule di Schwann terminali (SC) a giunzioni neuromuscolari (NMJs), è una sfida. &quot;Sequenziale foto-bleaching&quot; permette di delineare SC singolo terminale, per esempio nel triangularis espianto muscolo Sterni, un comodo nervo-muscolo preparazione, dove sequenziale sbiancamento può essere combinato con time-lapse imaging e<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunostainings.

Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Views.  Technische Universität München. Visualizzare le singole celle di densamente tessuti confezionati, come le cellule di Schwann terminali (SC) a giunzioni neuromuscolari (NMJs), è una sfida. "Sequenziale foto-bleaching" permette di delineare SC singolo terminale, per esempio nel triangularis espianto muscolo Sterni, un comodo nervo-muscolo preparazione, dove sequenziale sbiancamento può essere combinato con time-lapse imaging e Post-hoc Immunostainings.

Video: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Ricerca

Neuroscienze

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Rilevamento di<em&gt; In Situ</em&gt; Complessi proteina-proteina del<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissezione e immunoistochimica della gamba adulta di Drosophila per rilevare i cambiamenti alla giunzione neuromuscolare per un motoneurone identificato

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Visualizzazione delle caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare nel muscolo gastrocnemio mediale di ratto

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...