Questo protocollo può intuitivamente sperimentare risultati come il fenotipo osseo, gli indicatori metabolici e così via. L'applicazione principale di questo esperimento è la micro-CT, che può eseguire una ricostruzione 3D tissutale dell'analisi della morfologia ossea, maggiore sulla base di campioni di pelle. Per iniziare la procedura, applicare l'analgesia locale con un'iniezione topica di bupivacaina su un ratto adeguatamente anestetizzato.
Quindi utilizzare un batuffolo di cotone sterile per disinfettare l'area rasata con etanolo e iodio povidone tre volte. Utilizzando un bisturi, eseguire un'incisione della linea mediana di due centimetri sull'addome dell'animale. Esporre l'ovaio intatto usando una pinza e legare alla radice dell'ovaio usando una sutura chirurgica 4-0.
Rimuovere l'ovaio intatto utilizzando le forbici chirurgiche prima di suturare l'incisione della linea mediana. Dopo la somministrazione intragastrica del farmaco per quattro mesi e l'anestetizzazione dell'animale, tagliare e sbucciare la pelle dell'inguine per esporre l'arteria femorale utilizzando forbici e pinzette chirurgiche. Raccogliere un campione di sangue dall'arteria femorale utilizzando una provetta per la raccolta del sangue a vuoto.
Quindi applicare pressione con un batuffolo di cotone per fermare l'emorragia. Continuare a tagliare e sbucciare la pelle dell'inguine nell'arto inferiore per esporre la tibia intatta. Togliete la tibia e lavatela tre volte con soluzione fisiologica.
Utilizzando una pinzetta e le forbici oftalmiche, rimuovere il tessuto muscolare in eccesso dalla tibia posta in soluzione salina. Disinfettare la pelle posteriore dell'L4 lombare tre volte con etanolo e iodio povidone utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Usa forbici e pinzette chirurgiche per tagliare la pelle della schiena ed esporre l'L4 lombare. Recidere le vertebre superiori e inferiori della L4 lombare con un ronguer e tagliare l'osso sacro attorno ad esso con le forbici chirurgiche.
Rimuovere il tessuto muscolare in eccesso dal L4 lombare lavato e posto in soluzione salina utilizzando pinzette e micro forbici. Conservare la tibia e la vertebra L4 in un fluido tissutale di formalina al 10% a temperatura ambiente per tre giorni. Dopo aver acceso lo scanner micro CT, avviare il software per riscaldare la sorgente di raggi X.
Creare un database cliccando su crea nuovo campione per generare un file in cui salvare i dati prima di ottenere quello successivo. Nella finestra di controllo del software, assegnare i parametri di acquisizione dati. Impostare la tensione del tubo a raggi X a 50 kilovolt, la corrente del tubo a raggi X CT e la corrente del tubo a raggi X in tempo reale a 100 micro ampere, il campo visivo a 18 millimetri, nessuna tecnica di gating e la tecnica di scansione ad alta risoluzione in quattro minuti.
Dopo aver lavato la tibia con soluzione fisiologica tre volte, asciugare l'acqua in eccesso con carta da filtro. Avvolgere il fazzoletto della tibia sul letto con una pellicola di plastica per fissarne la posizione. Regolare il tessuto tibiale al centro del campo di imaging ruotando il pulsante nello strumento.
Chiudere lo sportello dello strumento e attivare la modalità live. Premere il pulsante di acquisizione per visualizzare il tessuto tibiale. Avviare la scansione facendo clic sul pulsante Scansione TC.
Fare clic su Sì per produrre l'immagine. Fare clic su salva immagine per salvare l'immagine nella cartella desiderata. Trasferire i campioni di tibia e vertebre L4 precedentemente conservati in formalina al 10% in una soluzione di acido formico al 20% per una decalcificazione di quattro giorni.
Dopo la decalcificazione, lavare la tibia e la vertebra L4 poste in una scatola di inclusione con acqua corrente per oltre sei ore. Disidratare i campioni con soluzioni alcoliche a concentrazione di gradiente in un processatore di tessuti automatizzato. Metti i campioni di tessuto nello xilene per due ore per renderli traslucidi.
Quindi posizionare i campioni permeabalizzati in cera di paraffina a 60 gradi Celsius per tre ore prima di incorporarli in un processore automatico. Ottenere sezioni di tessuto da 4 micron utilizzando un'affettatrice rotativa. Metti le sezioni nella colorazione con ematossilina per tre-otto minuti e nella colorazione con eosina per uno o tre minuti.
Trasferire le sezioni colorate in sequenza in alcool puro e xilene. Sigillare e fissare le sezioni con gomma neutra per visualizzarle al microscopio ottico. Per eseguire il recupero dell'epitopo indotto dal calore sulle sezioni della tibia, posizionare il foglio di supporto nel tampone di riparazione dell'antigene appropriato in un contenitore adatto al microonde.
Per la riparazione dell'antigene, cuocere il contenitore nel microonde per 20 minuti a 98 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il contenitore, sciacquare l'interno con acqua fredda del rubinetto per 10 minuti. Per bloccare l'attività endogena della perossidasi, incubare le fette di tibia con perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente.
Lavare le sezioni in PBS tre volte per cinque minuti ciascuna. Quindi incubare i campioni con una normale soluzione bloccante di siero di capra in una camera umida per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri ciascuno di RANKL, osteoprotegerina o OPG e anticorpi sclerostina nei campioni di fetta e incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius al buio.
Successivamente, incubare le sezioni con IgG anti-coniglio di capra marcate con biotina a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver risciacquato con PBS, utilizzare la diaminobenzidina per macchiarli per tre o cinque minuti a temperatura ambiente. Tingere le sezioni con ematossilina per uno o due minuti prima di sigillare le sezioni disidratate e secche con gomma neutra.
Aggiungere 25 microlitri di campione controllato, standard o campione a ciascuno dei rispettivi pozzetti. Quindi aggiungere 200 microlitri di 17 beta-estradiolo coniugato HRP a ciascun pozzetto. Coprire tutti i pozzetti con un foglio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore.
Dopo aver rimosso il liquido da ogni pozzetto, lavare i pozzetti tre volte con 300 microlitri di soluzione di lavaggio 1X. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato TMB a ciascun pozzetto e incubare. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzetto.
Agitare delicatamente la piastra per microtitolazione per 30 secondi prima di misurare l'assorbanza del campione a 450 nanometri entro 30 minuti. Le immagini micro TC ricostruite della tibia destra hanno rivelato che i cambiamenti strutturali trabecolari indotti dall'ovariectomia osservati nel gruppo modello OVX erano significativamente ridotti nei ratti ovariectomizzati trattati con la capsula di Bazi Bushen o il gruppo BZBS. Rispetto al gruppo SHAM, l'osso trabecolare nel gruppo OVX ha mostrato una significativa diminuzione della densità minerale ossea.
Una tendenza simile è stata osservata per la frazione di volume osseo, il numero di trabecole ossee e lo spessore delle trabecole ossee. Una tendenza opposta è stata osservata per il grado di separazione trabecolare. Rispetto ai gruppi OVX, la frazione di volume osseo, il numero di trabecole ossee e lo spessore trabecolare osseo nei gruppi di trattamento con Bazi Bushen sono aumentati significativamente e il grado di separazione trabecolare è stato notevolmente diminuito.
I risultati della colorazione con ematossilina ed eosina hanno indicato che il danno istomorfologico nella tibia nelle vertebre L4 di ratti ovariectomizzati è stato alleviato dopo la somministrazione di Bazi Bushen. I risultati dell'immunoistochimica hanno mostrato che, rispetto ai gruppi OVX, i gruppi di trattamento con Bazi Bushen hanno mostrato una ridotta espressione di RANKL, un aumento dell'espressione di OPG e una ridotta espressione di SOST. Vari marcatori biochimici del metabolismo osseo nei ratti ovariectomizzati sono stati migliorati anche dal trattamento con Bazi Bushen.
L'applicazione della micro CT è altamente riutilizzabile per la ricerca ossea. Questa tecnologia è molto comoda per illuminare la struttura ossea e può essere utilizzata secondo il passaggio tre.
