I due metodi di analisi fenotipica qui presentati offrono immagini di alta qualità che sono sufficienti per condurre analisi fenotipiche quantitative e per dimostrare le risposte fenotipiche del trattamento peptidico con dettagli epidermici. Di conseguenza, questi due metodi possono essere utilizzati per comprendere il pattern e lo sviluppo delle cellule epidermiche. Questi due metodi sono tecniche relativamente facili e affidabili in quanto non richiedono sostanze chimiche tossiche o pezzi epidermici ampiamente utilizzati per l'analisi fenotipica epidermica.
Tuttavia, le tecniche sono complicate e richiedono una formazione specializzata. Per iniziare, selezionare attentamente e ritagliare uno dei cotiledoni dalle singole piantine che crescono uniformemente con altre piantine sul piatto per limitare la variabilità. Porre ciascun cotiledone in una provetta da microcentrifuga contenente un millilitro di una soluzione di fissaggio con una pinza e lasciare il campione nella soluzione di fissaggio per una notte a temperatura ambiente.
Rimuovere la soluzione di fissaggio e aggiungere un millilitro di etanolo al 70%. Capovolgere il tubo un paio di volte e lasciare il tubo contenente i campioni a temperatura ambiente per circa 30 minuti. Ripeti questo passaggio usando un millilitro di etanolo al 50% e poi al 20% di etanolo.
Sostituire un millilitro di etanolo al 20% con un millilitro di acqua distillata, capovolgere il tubo contenente i campioni di cotiledone alcune volte e lasciarlo per circa 30 minuti. Rimuovere tutta l'acqua distillata dal tubo e aggiungere immediatamente circa 200 microlitri di soluzione colorante Toluidina Blue O o TBO per circa due minuti. Rimuovere la soluzione colorante TBO il più accuratamente possibile e quindi lavare immediatamente i campioni un paio di volte aggiungendo un millilitro di acqua distillata fresca.
In una cappa a flusso laminare, trapiantare con cura da 10 a 12 piantine di Arabidopsis di un giorno da ciascuna delle due piastre preparate in una piastra da 24 pozzetti contenente 1,5 millilitri di mezzo liquido mezzo MS in ciascun pozzetto. Aggiungere 50 millimolari tampone tris HCL da solo o due diverse concentrazioni del peptide a ciascun pozzetto contenente le piantine germinate su mezze piastre di agar MS. Mescolare delicatamente le piantine con il tampone da solo o una soluzione peptidica usando una pipetta e sigillare la piastra con nastro micropore.
Incubare la piastra di analisi in condizioni di lunga giornata per cinque-sette giorni a 22 gradi Celsius. Trasferire la piantina dal pozzo su un vetrino di copertura e sezionare il cotiledone della piantina. Posizionare il lato abassiale del cotiledone usando una pinza e tagliarlo a pezzetti.
Prendi un altro vetrino da microscopio pulito e posiziona una goccia di soluzione di ioduro di propidio su di esso. Posizionare uno dei piccoli pezzi di cotiledone nella goccia usando una pinza e posizionare delicatamente il coprifoglio. Applicare un'ulteriore soluzione di ioduro di propidio sul bordo del coprivetrino per rimuovere eventuali bolle d'aria che si formano.
Immagine del lato abassiale del cotiledone usando un microscopio confocale e confronta le immagini con le immagini di piantine coltivate in mezzo MS contenente solo tampone. Qui sono mostrate immagini di cotiledoni abassiali da piantine di 10 giorni di tre genotipi di Arabidopsis, wild type, una linea silenziata STOMAGEN e mutanti epf1 epf2. Qui, la linea silenziata STOMAGEN rappresenta i genotipi con basso numero di stomi e i mutanti epf1 epf2 rappresentano i genotipi con un alto numero di stomi.
Le immagini rappresentative dell'epidermide di cotiledoni da piantine di 10 giorni di wild type, tmm e linee transgeniche portatrici di un costrutto di sovraespressione epf2 o epf1 inducibile da estradiolo sono state utilizzate per l'analisi quantitativa del fenotipo epidermico. In questa figura sono mostrate le immagini confocali rappresentative del wild type e dell'epidermide cotiledonica epf2 coltivata per sei-sette giorni in una soluzione tampone e di un'epidermide cotiledonica epf2 coltivata con due diversi lotti di peptidi epf2. Eseguendo questa procedura, assicurati di tagliare uno dei cotiledoni da una singola piantina che sta già crescendo uniformemente con le altre piantine.
Scegli anche una piantina che non tocchi il supporto MS per limitare la variabilità. Un altro punto da ricordare è che non posizionare più di cinque cotiledoni in una singola provetta di microcentrifuga. Inoltre, sfiorare delicatamente il tubo per garantire una distribuzione uniforme delle macchie TBO intorno ai cotiledoni per colorarli bene.
Considerando l'esistenza di più peptidi strutturali in una soluzione peptidica, questo metodo di saggio biologico sarà molto utile per l'identificazione di forme di peptide correttamente piegate e bioattive e le loro funzioni biologiche.
