We are indebted to Xuefei Yang, Sabine Both, Lin Chen and Kaitian Wang for coordinating the fieldwork and establishing the BEF-China experiment. We are also grateful to the whole BEF-China research group for their general support. BEF-China is mainly funded by the German Research Foundation (DFG FOR 891/1 and 2) and funding for this particular project was provided by the German Research Foundation to H.B. (DFG BR 1698/9-2). We are also thankful for the travel grants and summer schools financed by the Sino-German Centre for Research Promotion in Beijing (GZ 524, 592, 698, 699 and 785). In addition we would like to thank David Eichenberg, Michael Staab, Katja Grotius, Silvana Tornack, Lin Chen, and Shouren Zhang for their support in the field and in the lab.

1. conduttanza stomatica <ol><li> Misure di conduttanza stomatica NOTA: Gli autori fatto uso di un semplice tipo di stabile porometer stato (Decagono SC1). Il design della porometer ha il vantaggio di piccole dimensioni, funzionamento manuale intuitivo ed alta affidabilità. Quando si misura la conduttanza stomatica nel campo, assicurarsi di minimizzare la distanza tra individui misurati per un ciclo di misurazione ripetuto per essere il più efficiente possibile. </li><li> Scegliere foglie di diverse specie e individui secondo un modello riproducibile (stessa altezza, stessa esposizione, stessa posizione all&#39;interno della pianta, se possibile solo dallo stesso nodo, e solo da una categoria, sole o all&#39;ombra foglie, etc.). <ol><li> Unica misura lascia in buona salute, condizione non danneggiata e pienamente sviluppato. Segnare le foglie sugli individui (ad esempio, con fascette o nastro di colore), per garantire che le misurazioni ripetute sono effettuate sulla stessa foglia. NOTA: misurazements di conduttanza stomatica devono essere effettuate solo sulla superficie del foglio evitando nervatura centrale e forti nervature. </li><li> Avviare misure nelle prime ore del mattino prima dell&#39;alba di prendere cinque a dieci misurazioni ripetute fino a quando i valori conduttanza stomatica mostra un evidente declino a mezzogiorno. NOTA: un corso quotidiano di misure consegnerà buoni dati per analizzare le relazioni tra VPD e conduttanza stomatica. </li></ol></li><li> Misure Vpd <ol><li> Con ogni g misura S, registrare la temperatura e l&#39;umidità relativa preferibilmente con registratori portatili per misurare direttamente le condizioni nella posizione della stessa foglia. Per il calcolo del deficit di pressione di vapore utilizzare la formula agosto-Roche Magnus 15. </li></ol></li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq1.jpg" width="300" /> = saturazione del vapore acqueo e la pressione s [hPa] <ol start="4"><li> Modello g S - risposta VPD <ol><li> Ora specie-saggio di scena tutti i dati g S contro vpd, che unisce tutti i corsi giornalieri di singole foglie in un&#39;analisi ogni specie. Estrarre il massimo valore rilevato dai dati conduttanza stomatica ricercando il massimo valore. Per scalare il modello per le specie-saggio comparabilità, dividere i valori osservati attraverso il valore massimo osservato per quella specie (g S / g SMAX). </li><li> Per ogni specie, regredire i logit di g (S g S / g SMAX) per VPD e il termine quadratico di VPD utilizzando un modello lineare generalizzato con una distribuzione binomiale di errore (a, b e c rappresentano parametri di regressione): </li></ol></li></ol><img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738eq2.jpg" width="300" /><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" whezza = &quot;700&quot; /&gt; Figura 1. Esempio dei valori tracciati e il modello adattato per g S -. VPD conduttanza stomatica grafico in funzione del deficit pressione di vapore per la specie Liquidambar formosana. Punti vuoti rappresentano i valori osservati. (A) conduttanza massima stomatica, la VPD alla massima conduttanza stomatica e dire conduttanza stomatica è stato estratto dalla conduttanza assoluto quindi non in scala stomatica (g S) dei dati. (B) i dati degli stomi conduttanza Scaled (g S / g SMAX) sono stati tracciati per estrarre i parametri relativi (indicato come punti pieni) 20. Ristampa con il permesso di 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig2highres.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; Figura 2. Tutti i modelli a muro per tutte le specie. Grafici del modello per i dati di conduttanza stomatica a regressione vpd per tutte le specie. Specie sempreverdi sono rappresentate da linee nere, specie decidue da linee rosse 20. Re-stampa con il permesso di 20. NOTA: Usando i logit invece di regredire g S direttamente VPD, conduce al punto che modellato valori massimi non superiori g SMAX e che si avvicina a 0 g S all&#39;alta VPD. <ol start="5"><li> Estrarre parametro di regolazione stomatica per ogni specie <ol><li> Calcolare i valori SMAX modellata g assoluti (MaxFit in Figura 1B). Per fare questo, calcolare il VPD alla massima conduttanza stomatica da impostare la derivata prima di 1.4.2 a zero, che dà VPD gsMaxFit = -b / 2a. Inserire VPD gsMaxFit nella formula di 1.4.2 e aumentare la potenza di e per ottenere MaxFit. Calcolare il mean di tutte le misure di conduttanza per specie (Figura 1A). NOTA: Utilizzare software statistico R (http://www.r-project.org). </li><li> Per calcolare i valori relativi, dal modello in scala (g S / g SMAX), estrarre la conduttanza stomatica e valori VPD per i seguenti due punti: (1) conduttanza stomatica e VPD al massimo del modello (MaxFit) e (2) VPD nel secondo punto di flesso della curva (vedere Figura 1B). Moltiplicare i valori di g SMAX per ottenere valori assoluti g S per questi punti. Vedere Figura 2 per una sovrapposizione completa dei singoli modelli di tutte le 39 specie analizzate. </li></ol></li></ol> 2. Misure di stomi Tratti <ol><li> Prelevare campioni preferibilmente da esattamente gli stessi fogli che sono stati utilizzati per le misure di conduttanza stomatica. Se ciò non è possibile, applica la stessa procedura di selezione che è stata applicata per scegliere le foglieper le misure di conduttanza stomatiche, preferibilmente gli stessi individui. </li><li> Applicare uno strato sottile di incolori, rapida essiccazione smalto (test marche diverse, alcuni sono più adatti di altri) per un campione fresco. Se i campioni non possono essere elaborati immediatamente, conservarli nel 70% di alcol. Dopo lo smalto si è asciugato, buccia delicatamente l&#39;impressione dalla foglia e proseguire per l&#39;analisi al microscopio, come con un normale campione di foglia. NOTA: Nel caso di ante con alta densità trichome una fase precedente di applicare idrossido di sodio o una soluzione 1: 1 di perossido di acido acetico e ossigeno può portare a risultati migliori. </li><li> Analisi al microscopio ottico <ol><li> Collegare una fotocamera di un microscopio ottico capace di ingrandimenti tra 40X a 400X. Dopo che la fotocamera è collegata al microscopio, abbinare le immagini prese alla ingrandimento ottico e risoluzione dell&#39;immagine, ad esempio, con l&#39;aiuto di una scala. </li><li> Impiegando i open sourcesoftware di elaborazione mago come ImageJ 16 analizzare queste immagini. <ol><li> Disegnare una forma con lo strumento forma dallo strumento di analisi delle immagini sull&#39;immagine in una zona senza sporcizia, pollice stampa, aree danneggiate, o grandi vene del foglio. Conte stomi in questo settore e in totale di almeno 50.000 micron 2 campione per. </li><li> Misurare guardia degli stomi lunghezza delle cellule e la lunghezza dei pori. Calcolare il numero di stomi per mm 2. Calcolare l&#39;indice stomatico come il rapporto tra la densità degli stomi per epidermica numero di cellule per mm 2. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Valutazione della vena del foglio Tratti NOTA: Per la valutazione dei tratti foglia vena, una modifica di un protocollo da Sack &amp; Scoffoni 17 è stato impiegato. <ol><li> preparazione del campione NOTA: Per ottimizzare la visibilità delle vene del foglio, le foglie vengono prima sbiancato e poi colorato con safranine e verde malachite. <ol><li> Per sbiancare la leaves, lasciare loro almeno 72 ore nel 50% soluzione decolorante (prova diverse marche, ancora alcuni potrebbero funzionare meglio). In alternativa, utilizzare 5% soluzione di NaOH soluzione o soluzione di KOH al 10% o 25% H 2 O 2. </li><li> Riscaldare la soluzione fino a 30 ° C o combinare le diverse soluzioni dal punto 3.1.1 per gli effetti migliori. Sciacquare più volte in acqua in seguito. Adattare il processo di sbiancamento della specie specifici, a seconda delle loro caratteristiche foglia. NOTA: più spessa foglie possono avere bisogno di periodi di vasca e soluzione o le soluzioni più aggressive più lunghi. Tenere foglie più sottili e più possono essere sbiancate in misura soddisfacente, in meno di 72 ore. </li><li> Per colorare le foglie li mettono in 100% di etanolo. Colorarli per 2 - 30 min in soluzione safranine 1%. Per migliorare la colorazione, aggiungere un ulteriore trattamento con 1% di soluzione di verde malachite solo per alcuni secondi. Adattare il protocollo di ogni specie in termini di tempi e di intensità per ottenere risultati ottimali. Sciacquare sevolte Veral in acqua in seguito. Se le foglie sono di macchiato profondamente, qualche tempo in etanolo o decolorante può aiutare. </li></ol></li><li> L&#39;analisi dei campioni <ol><li> Scansione le foglie con uno scanner retroilluminazione a una risoluzione di circa 1.200 dpi. Abbinare le scansioni adottate per la risoluzione dell&#39;immagine, ad esempio, con l&#39;aiuto di una scala, per garantire che la lunghezza pixel può essere fatta risalire a misure assolute lunghezza della foglia scansionata. </li><li> Misurare zona, circonferenza, lunghezza e larghezza delle foglie. Calcola diversi indici, ad esempio, la lunghezza / larghezza e circonferenza 2 / zona. Tagliare un 1 da 1 centimetro rettangolo di fuori del centro della foto. Misurare il diametro delle vene di primo e secondo ordine (non includa il principale centro vena). Misurare la lunghezza di tutti vene di primo ordine in questo Quadrat (densità vena). </li></ol></li></ol> 4. Valutazione dei Altri Leaf Tratti NOTA: Asses tipici tratti foglia, come specificasuperficie fogliare (SLA), foglia tenore di sostanza secca (LDMC), area fogliare, contenuto degli elementi, foglia abitudine, foglia pennazione, foglia tipo composto, foglia tipo margine ecc seguenti protocolli 18,19 stabilito. <ol><li> Tratti foglia osservazionali <ol><li> Valutare foglia pennazione, foglia tipo composto, foglia tipo margini e la presenza di nettarii extrafloral 18,19 attraverso l&#39;osservazione sul campo. </li></ol></li><li> Tratti foglia analitici <ol><li> Raccogliere campioni di foglie fresche, preferibilmente gli stessi individui a quelli utilizzati per le altre misure, per la determinazione della specifica area fogliare (SLA), area fogliare e foglia sostanza secca (LDMC) 18,19. Dopo 48 ore in forno a 80 ° C, misurare contenuto degli elementi e rapporti, preferibilmente sulle stesse foglie. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

I parametri di regolazione degli stomi estratti con il metodo presentato in questo documento sottolineano l&#39;importanza di tratti stomatici, come la densità e l&#39;indice di stomi stomi. Questi nuovi rapporti dimostrano il potenziale di collegare i parametri da modelli fisiologici a morfologici, anatomici e foglia chimica Tratti 20. Rispetto ad altri metodi, il presente approccio porta il vantaggio di catturare un valore VPD unico e inequivocabile in cui la conduttanza stomatica è down-regolato a metà della g modellato s massimo. Di tutti i passaggi descritti nel protocollo i più critici sono le misure di conduttanza stomatica. A causa della regolamentazione multifattoriale delle condizioni atmosferiche ambientali conduttanza stomatica avere una forte influenza sul g S. Misure di conduttanza stomatica ad alta umidità relativa e bassa intensità di luce possono essere inaffidabili 21-23. Per quanto riguarda morfologica e Anattratti omical, il protocollo devono sempre essere adattate alle specie bersaglio inclusi nello studio. In particolare nell&#39;analisi della densità ottica, la durata di sbianca e colorazione delle foglie deve essere variata, a seconda della struttura del foglio e tenacità. I potenziali limitazioni del metodo sono le specie per le quali le misure di conduttanza stomatica sono impossibili o eccessivamente complesso e soggetto a errori a causa di forme di foglie straordinari. Questo può includere conifere e erbe con lamine fogliari molto stretti. I nostri risultati confermano in parte la prima ipotesi di un legame tra i parametri di conduttanza stomatica e tratti fogliari dello spettro foglia economia (LES), che corrisponde a molti altri studi. Ad esempio, Poorter e Bongers (2006) 24 hanno riportato uno stretto legame tra g S e le caratteristiche rappresentate dal LES, per esempio, con g S decrescenti con l&#39;aumento della durata della vita foglia. Pertanto, Schulze et al. (1994) 1 demonstchiari collegamenti nominali tra il contenuto del foglio di azoto e g SMAX. Allo stesso modo, Juhrbandt et al. (2004) 25 hanno trovato relazioni significative tra g SMAX e superficie fogliare e foglia d&#39;azoto. La nostra seconda ipotesi di nette differenze per quanto riguarda la foglia abitudine non ha potuto essere confermata. L&#39;elevata variazione dei parametri misurati e le caratteristiche all&#39;interno di sempreverdi e caducifoglie foglia abitudine indicano che foglia abitudine non è un buon descrittore del LES. Brodribb e Holbrook (2005) 26 hanno discusso quella foglia abitudine e foglia strategie fisiologiche non possono essere necessariamente collegati da un&#39;ampia variazione caratteristica è comune in tutti i tipi di foglia abitudine. L&#39;approccio può essere esteso a tratti e le caratteristiche fisiologiche di organi vegetali diverse foglie, ad esempio per i tratti legati all&#39;idraulica xilema quali xilema specifica conduttività idraulica e legno microscopia Tratti 27. Analogamente, altritipi di tratti a foglia come derivati ​​da microscopia come la struttura a palizzata parenchima e epicuticolare struttura a strati di cera potrebbero essere inclusi 28. In sintesi, questo studio ha confermato la stretta connessione tra il LES e regolazione stomatica. Inoltre, il metodo presentato qui ha rivelato aspetti di modelli di regolazione stomatiche che non sono legati al LES. Soprattutto specifici tratti foglia come la dimensione stomi, la densità e l&#39;indice, così come la lunghezza vena meritano attenzione in futuro studi vegetali funzionali.

Per far avanzare la comprensione funzionale di foglie delle piante, molti studi recenti hanno tentato di mettere in relazione morfologici, anatomici e tratti foglia chimica per risposte fisiologiche, come la foglia di conduttanza stomatica (g S) 1-4. Inoltre, per i tratti di foglia, conduttanza stomatica è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, come fotosinteticamente fotone attivo densità di flusso, temperatura dell&#39;aria e VPD 5. Vari modi sono stati proposti per modellare gs - curve VPD 6-8 che si basano principalmente sulla regressione lineare di gs su VPD 6. Al contrario, il modello presentato in questo studio i regredisce logit di relativa conduttanza stomatica (cioè il rapporto di g S a massima conduttanza stomatica SMAX g) su VPD e spiega la non linearità aggiungendo vpd come termine regressore quadratico. Rispetto ad altri modelli, il nuovo modello consente per derivare parametri che descrivonoil VPD in cui g S è down-regolato dalla mancanza di acqua. Analogamente, la VPD è ottenuta in cui g S è massima. Come tali parametri fisiologici si può aspettare di essere strettamente legata alla assimilazione di carbonio 9,10 uno stretto legame tra questi parametri del modello e le caratteristiche chiave del foglio di allocazione dei nutrienti e delle risorse illustrate nel LES dovrebbe essere previsto 3,11. Di conseguenza, ci dovrebbe essere anche una stretta relazione tra le strategie di regolazione degli stomi con tratti LES. Tale rapporto è previsto in particolare per foglia abitudine (sempreverde contro decidue) come foglia abitudine si sia correlata con il LES e con l&#39;uso dell&#39;acqua efficienza 12,13. Specie sempreverdi tendono a crescere più lentamente, ma sono più efficienti in ambienti poveri di sostanze nutritive 14. Così, foglia abitudine dovrebbe tradursi in differenti modelli di regolazione degli stomi, con una strategia di utilizzo di acqua più conservatore di specie decidue. Comparing un grande insieme di specie arboree a foglia larga in una situazione comune giardino, le seguenti ipotesi sono stati testati: 1) i parametri del modello di g S - modelli VPD sono collegati a tratti fogliari relative allo spettro foglia economia. 2) specie sempreverdi hanno valori inferiori media g S e g SMAX di specie decidue.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>SC 1 Porometer</td>
			<td>Decagon</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other porometer is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable ties to mark leaves</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sample bags</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygrometer</td>
			<td>Trotec</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 plus</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any other is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% NaOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% KOH</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% H2O2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malachite green</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranine</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

relating stomatal conductance to leaf functional traits

Caratteri funzionali Leaf sono importanti perché riflettono funzioni fisiologiche, come la traspirazione e l&#39;assimilazione di carbonio. In particolare, i tratti fogliari morfologiche hanno il potenziale di riassumere le strategie di impianti in termini di efficienza d&#39;uso dell&#39;acqua, modello di crescita e l&#39;uso di sostanze nutritive. Lo spettro foglia economia (LES) è una struttura riconosciuta a funzionale ecologia vegetale e riflette un gradiente di aumentare specifica area fogliare (SLA), foglia di azoto, fosforo e tenore di cationi, e diminuendo foglia tenore di sostanza secca (LDMC) e il rapporto di azoto carbonio ( CN). Il LES descrive diverse strategie che vanno da quello delle foglie di breve durata con elevata capacità fotosintetica per massa foglia di foglie longevi con tassi bassi a base di massa di assimilazione di carbonio. Tuttavia, i tratti che non sono inclusi nel LES potrebbero fornire ulteriori informazioni sulla fisiologia della specie, come ad esempio quelli relativi al controllo stomi. I protocolli sono presentati per una vasta gamma di foglia functiotratti nale, tra cui tratti del LES, ma anche tratti che sono indipendenti dal LES. In particolare, un nuovo metodo viene introdotta che mette in relazione il comportamento di regolamentazione delle piante della conduttanza stomatica per deficit pressione di vapore. I parametri risultanti di regolazione degli stomi possono quindi essere confrontati con il LES e altri tratti funzionali della pianta. I risultati mostrano che i tratti funzionali foglia della LES erano predittori validi per i parametri di regolazione stomi. Ad esempio, la concentrazione di carbonio foglio era positivamente correlata al deficit pressione di vapore (VPD) nel punto di flesso e il massimo della curva conduttanza-VPD. Tuttavia, i tratti che non sono inclusi nel LES aggiunte informazioni per spiegare parametri di controllo stomatico: il VPD al punto di flesso della curva conduttanza-VPD era più bassa per le specie con una maggiore densità degli stomi e l&#39;indice stomatico superiore. Nel complesso, stomi e vena tratti erano predittori più potenti per spiegare regolazione stomatica ttratti han utilizzati nel LES.

Molti parametri di conduttanza stomatica e stomatica regolazione sono stati trovati essere correlato a morfologici, anatomici e tratti foglia chimici. Di seguito, il focus sarà sui link per VPD nel punto di inflessione, che si è ridotto con la densità degli stomi (p = 0,04) e l&#39;indice stomatico (p = 0.03) e aumenta con il contenuto del foglio di carbonio (p = 0,02, Vedi Figura 3). I risultati mostrano che al diminuire VPD al punto di inflessione c&#39;era una diminuzione della densità e l&#39;indice stomatico stomatico. Al contrario, nessun parametro di conduttanza stomatica ha mostrato una chiara relazione di foglia abitudine. L&#39;elevata variabilità all&#39;interno dei due gruppi di foglia abitudine mostra che diversi meccanismi di regolazione esistono sia all&#39;interno del gruppo di sempreverdi e abitudini foglia caduca. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Risultato dato the collegamenti tra i modelli di stomatiche regolazione conduttanza e foglia tratti deficit di pressione di vapore (VPD) presso il punto di inflessione della g S -. curva VPD (VpdPoi) in funzione di (A) Densità stomi, (B) Indice stomi, e (C) foglie contenuto di carbonio 20. Ristampa con il permesso di 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52738/52738fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Relating Stomatal Conductance to Leaf Functional Traits

Svelare come la fisiologia e la morfologia sono collegati permette una più profonda comprensione meccanicistica funzionamento di foglie delle piante. Vi presentiamo sia una procedura per ricavare i parametri di regolazione degli stomi da misure conduttanza stomatica e correlazioni con tradizionali tratti fogliari funzionali.

Relative conduttanza stomatica a Leaf tratti funzionali

Leaf functional traits are important because they reflect physiological functions, such as transpiration and carbon assimilation. In particular, ...

relating-stomatal-conductance-to-leaf-functional-traits

Research

JoVE Journal

Biology

18.9K Views.  Martin-Luther-University Halle-Wittenberg.  Svelare come la fisiologia e la morfologia sono collegati permette una più profonda comprensione meccanicistica funzionamento di foglie delle piante. Vi presentiamo sia una procedura per ricavare i parametri di regolazione degli stomi da misure conduttanza stomatica e correlazioni con tradizionali tratti fogliari funzionali. 

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Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Espressione e purificazione della proteina transmembrana cistica regolatore fibrosi conduttanza in Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Ricerca

Biologia

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to achieve a high stomatal conductance (gs) to capture CO2 for photosynthesis, water is lost by transpiration1,2. Water evaporating from the airspaces is replaced from cell walls, in turn drawing water from the xylem of leaf veins, in turn drawing from xylem in the stems and roots. As water is pulled through the system, it experiences hydraulic resistance, creating tension throughout the system and a low leaf water potential (&Psi;leaf). The leaf itself is a critical bottleneck in the whole plant system, accounting for on average 30% of the plant hydraulic resistance3. Leaf hydraulic conductance (Kleaf = 1/ leaf hydraulic resistance) is the ratio of the water flow rate to the water potential gradient across the leaf, and summarizes the behavior of a complex system: water moves through the petiole and through several orders of veins, exits into the bundle sheath and passes through or around mesophyll cells before evaporating into the airspace and being transpired from the stomata. Kleaf is of strong interest as an important physiological trait to compare species, quantifying the effectiveness of the leaf structure and physiology for water transport, and a key variable to investigate for its relationship to variation in structure (e.g., in leaf venation architecture) and its impacts on photosynthetic gas exchange. Further, Kleaf responds strongly to the internal and external leaf environment3. Kleaf can increase dramatically with irradiance apparently due to changes in the expression and activation of aquaporins, the proteins involved in water transport through membranes4, and Kleaf declines strongly during drought, due to cavitation and/or collapse of xylem conduits, and/or loss of permeability in the extra-xylem tissues due to mesophyll and bundle sheath cell shrinkage or aquaporin deactivation5-10. Because Kleaf can constrain gs and photosynthetic rate across species in well watered conditions and during drought, and thus limit whole-plant performance they may possibly determine species distributions especially as droughts increase in frequency and severity11-14.
We present a simple method for simultaneous determination of Kleaf and gs on excised leaves. A transpiring leaf is connected by its petiole to tubing running to a water source on a balance. The loss of water from the balance is recorded to calculate the flow rate through the leaf. When steady state transpiration (E, mmol &bull; m-2 &bull; s-1) is reached, gs is determined by dividing by vapor pressure deficit, and Kleaf by dividing by the water potential driving force determined using a pressure chamber (Kleaf= E /- &Delta;&psi;leaf, MPa)15.
This method can be used to assess Kleaf responses to different irradiances and the vulnerability of Kleaf to dehydration14,16,17.

Measurement of Leaf Hydraulic Conductance and Stomatal Conductance and Their Responses to Irradiance and Dehydration Using the Evaporative Flux Method EFM

We describe a relatively rapid (30 min) and realistic method for simultaneously measurement of leaf hydraulic conductance (Kleaf) and stomatal conductance (gs) for transpiring excised leaves. The method can be modified to measure the light and dehydration responses of Kleaf and gs.

Misurazione della Leaf conduttanza idraulica e conduttanza stomatica e le loro risposte ad irraggiamento e disidratazione con il metodo del flusso evaporativo (EFM)

Water is a key resource, and the plant water transport system sets limits on maximum growth and drought tolerance. When plants open their stomata to ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificazione della fibrosi cistica regolatore della conduttanza transmembrana proteina espressa in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular systolic and diastolic function. Measures of ventricular contractility and compliance are obtained through examination of cardiac response to changes in afterload and preload. These techniques were originally developed nearly three decades ago to measure cardiac function in large mammals and humans. The application of these analyses to small mammals, such as mice, has been accomplished through the optimization of microsurgical techniques and creation of conductance catheters. Conductance catheters allow for estimation of the blood pool by exploiting the relationship between electrical conductance and volume. When properly performed, these techniques allow for testing of cardiac function in genetic mutant mouse models or in drug treatment studies. The accuracy and precision of these studies are dependent on careful attention to the calibration of instruments, systematic conduct of hemodynamic measurements and data analyses. We will review the methods of conducting pressure-volume loop experiments using a conductance catheter in mice.

Cardiac pressure-volume loop analysis is the most comprehensive way to measure cardiac function in the intact heart. We describe a technique to perform and analyze cardiac pressure volume loops, using conductance catheters.

Cardiac pressione Volume Analysis Loop Utilizzando conduttanza Cateteri nei topi

Cardiac pressure-volume loop analysis is the &#8220;gold-standard&#8221; in the assessment of load-dependent and load-independent measures of ventricular ...

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants (Atta) in Laboratory Conditions

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled environments enables an enriched comprehension of their biology that can contribute to applied research. This practice is usually employed in population control studies of species that cause economic loss, such as Atta ants. To cultivate their mutualistic fungus, these leaf-cutting ants collect leaves and for this are considered agricultural pests widely distributed throughout the American continent. They are highly socially organized and inhabit elaborated underground nests composed of a variety of chambers. Their maintenance in a controlled environment depends on a daily routine of several procedures and frequent care that are described here. It starts with the collection of queens during the reproductive season (i.e., nuptial flight), which are then individually transferred to plastic containers. Due to the high mortality rate of queens, a second collection can be carried out about 6 months after the nuptial flight, when incipient nests with developed fungus wad are excavated, hand-picked, and placed in plastic containers. In the laboratory, leaves are daily provided to established colonies, and ant-produced waste is weekly removed along with remaining dry plant material. As the fungus garden keeps growing, colonies are transferred to different types of containers according to the experimental purpose. Leaf-cutting ant colonies are placed in interconnected containers, representing the organizational system with functional chambers built by those insects in nature. This setup is ideal to monitor factors such as waste amount, fungus garden health, and the behavior of workers and queen. Facilitated data collection and more detailed observations are considered the greatest advantage of keeping ant colonies in controlled conditions.

Collection and Long-Term Maintenance of Leaf-Cutting Ants Atta in Laboratory Conditions

Here, a protocol is described to successfully collect and maintain healthy Atta (Hymenoptera: Formicidae) ant colonies in laboratory conditions. Additionally, different nest types and configurations are detailed together with possible experimental procedures.

Raccolta e mantenimento a lungo termine delle formiche tagliafoglie (Atta) in condizioni di laboratorio

Ants are one of the most biodiverse groups of animals on the planet and inhabit different environments. The maintenance of ant colonies in controlled ...

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant productivity and survival. As such, understanding the mechanisms by which stomata develop and pattern has tremendous agronomic value. This paper describes two phenotypic methods using Arabidopsis cotyledons that can be used to characterize the genes controlling stomatal development and patterning. Presented first are procedures for analyzing the stomatal phenotypes using toluidine blue O-stained cotyledons. This method is fast and reliable and does not require the use of epidermal peels, which are widely used for phenotypic analyses but require specialized training. Due to the presence of multiple cysteine residues, the identification and generation of bioactive EPF peptides that have a role in stomatal development have been challenging. Thus, presented second is a procedure used to identify stomatal ligands and monitor their biological activity by bioassays. The main advantage of this method is that it produces reproducible data relatively easily while reducing the amount of peptide solution and the time required to characterize the role of the peptides in controlling stomatal patterning and development. Overall, these well-designed protocols enhance the efficiency of studying the potential stomatal regulators, including cysteine-rich secretory peptides, which require highly complex structures for their activity.

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

This paper describes two phenotyping methods without the use of epidermal peels to characterize the genes controlling stomatal development. The first method demonstrates how to analyze a stomatal phenotype using a toluidine blue O-stained plant epidermis. The second method describes how to identify stomatal ligands and monitor their biological activities.

Identificazione dei geni coinvolti nello sviluppo stomatale tramite punteggio del fenotipo epidermico

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Un semplice protocollo per mappare i tratti dell'architettura del sistema di root delle piante

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Indagine spaziotemporale della dinamica ERL1 tramite imaging confocale

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Autore in primo piano: Metodi basati su immagini per studiare gli eventi di traffico di membrana nelle cellule del lignaggio stomatico  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Metodi basati su immagini per studiare eventi di traffico di membrana in cellule di lignaggio stomatico

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...