Hello.Today vi mostreremo un protocollo che protoplasme milioni di cellule di mesofillo di mais e le trasformeremo ad alta efficienza. I passaggi principali del protocollo sono prima di tutto digerire e rimuovere la parete cellulare della pianta, rilasciare i protoplasti e quindi trasformare il protoplasto usando PEG. La grande differenza tra questo protocollo e gli altri è la scala di trasformazione.
La maggior parte dei protocolli finisce con tra 1.000 e 10.000 protoplasti trasformati. Tuttavia, il nostro protocollo fornisce milioni di protoplasti di mais trasformati. Qui abbiamo piantine di mais coltivate al buio da nove a 11 giorni dopo la germinazione.
Tagliare le piantine appena sopra il livello del terreno e metterle in acqua. Tenere le piante al buio quando non in uso. Seleziona la seconda e la terza foglia di ogni piantina, avendo cura di escludere foglie con zone marroni o danneggiate.
Seleziona da 12 a 16 foglie e taglia un centimetro dalle punte. Quindi tagliare una sezione di 10 centimetri da ogni foglia. Impilare le sezioni fogliari una sopra l'altra con le estremità basali insieme.
Fissare il fascio insieme all'estremità basale usando una clip legante. Metti il fascio di foglie su un pezzo di carta bianca. Tagliare fette di foglie larghe da 0,5 a un millimetro.
È importante tagliare fette sottili e consistenti. Dopo aver tagliato parte del fascio fogliare, trasferire le fette nella soluzione enzimatica. Non lasciare che il materiale si asciughi.
Ruotare delicatamente la soluzione enzimatica per bagnare il materiale. Posizionare un foglio sopra il becher per bloccare la luce. Ripetete questo processo fino a quando l'intero pacchetto non viene tagliato vicino alla clip raccoglitrice.
Dopo il taglio, la soluzione dovrebbe assomigliare a questa. Trasferire il becher della soluzione enzimatica in un barattolo a campana. Infiltrarsi sottovuoto per tre minuti a temperatura ambiente.
Incubare su uno shaker da tavolo a 40 RPM a temperatura ambiente per due ore e mezza. Dopo l'incubazione, dare alla soluzione un vortice. Dovrebbe apparire lattiginoso, indicando una digestione di successo.
Incubare sullo shaker da tavolo a 80 RPM a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Posizionare il becher con la soluzione enzimatica sul ghiaccio. Interrompere la digestione aggiungendo un volume di MMG ghiacciato.
Filtrare attraverso un filtro a celle da 40 micron in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Dividere la soluzione in aliquote di non più di 10 millilitri ciascuna. Versare nei tubi di vetro con fondo rotondo refrigerato.
Centrifugare i tubi a 100 g per quattro minuti. Rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere, quindi raggruppare i campioni per i lavaggi successivi.
Lavare i protoplasti due volte con cinque millilitri di MMG. Girare ogni volta a 100 G per tre minuti. Il pellet dovrebbe essere di un bel colore verde giallo brillante.
Sarai in grado di risospendere il pellet ruotando delicatamente il tubo. Risospendere in un millilitro di MMG e diluire una piccola aliquota da 10 a 20x per il conteggio. È importante risospendere bene prima dell'aliqouting, poiché i protoplasti si stabilizzeranno rapidamente.
Caricare i protoplasti diluiti nell'emocitometro. Contare i protoplasti al microscopio ottico. Una buona preparazione non avrà molti detriti in eccesso che galleggiano dopo il lavaggio.
I protoplasti buoni sono circolari con plastidi visibili. Utilizzare il conteggio delle celle per calcolare il numero totale. Questa preparazione ha portato a poco più di 10 milioni di protoplasti.
Si consiglia di verificare la vitalità utilizzando colorante diacetato di fluoresceina. Gli isolamenti dei protoplasti di successo producono una vitalità tra il 70 e il 90%Mescolare i protoplasti con il plasmide di interesse. Questo esempio utilizza 1 milione di protoplasti e 15 microgrammi di DNA.
Incubare sul ghiaccio per 30 minuti. Risospendere toccando il lato del tubo. Aggiungere la soluzione PEG per raggiungere una concentrazione finale del 12% di PEG.
Mescolare delicatamente capovolgendo più volte. I protoplasti e la soluzione PEG sono fragili, quindi non agitare il tubo. Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti.
Diluire con cinque volumi di soluzione di incubazione e mescolare delicatamente per inversione. Centrifugare i tubi a 100 g per quattro minuti. Lavare una volta con un millilitro di tampone di incubazione.
Fare attenzione a non disturbare il pellet. Girare a 100 G per tre minuti. Risospendere nel tampone di incubazione ad una concentrazione da 500 a 1000 cellule per microlitro.
Incubare al buio durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno dopo, girare a 100 G per quattro minuti. Lavare due volte con una soluzione di incubazione refrigerata.
Centrifugare ogni volta per tre minuti a 100 G a temperatura ambiente. Risospendere, quindi caricare una piccola aliquota sull'emocitometro per il controllo finale. Innanzitutto, conta il numero totale di protoplasti sotto campo luminoso.
Ora, osservate la frazione di protoplasti che fluoreggiano sotto UV per verificare la trasfezione. I protoplasti stanno esprimendo il nostro reporter GFP. Ora, otteniamo alcune metriche sull'efficienza della trasfezione.
In questa preparazione, abbiamo ottenuto 10 milioni di protoplasti totali, di cui abbiamo trasfettato 1 milione. Il giorno dopo, ne abbiamo recuperati 335.000. Di questi, abbiamo avuto un tasso di trasformazione del 30,3% Questo ci lascia con il nostro totale di circa 100.000 protoplasti che esprimono GFP.
L'efficienza della trasfezione può variare. Come si può vedere nel grafico, vediamo regolarmente efficienze tra il 20 e il 50% tra i preparativi ripetuti. Questo protocollo consente la raccolta e la trasformazione di milioni di protoplasti di mesofillo di mais.
Una delle parti migliori del protocollo è la sua capacità di scalare. Scalando la quantità di volume e il numero di protoplasti utilizzati nella trasformazione, è possibile aumentare la trasformazione di oltre un ordine di grandezza rispetto a quanto mostrato oggi. Ad oggi, il nostro più grande esperimento a tubo singolo è iniziato con 20 milioni di protoplasti e 200 microgrammi di DNA e si è concluso con 3,1 milioni di protoplasti trasformati il giorno successivo.
Questo protocollo ad alto rendimento è particolarmente utile quando è necessario testare molti diversi costrutti plasmidici, ma i collaboratori hanno utilizzato questo protocollo per scopi che non richiedono la capacità di scalare, come la progettazione di circuiti genici sintetici e mais. Grazie per aver guardato il nostro video. Speriamo che sia stato d'aiuto.
