Name: lateral root inducible system in arabidopsis and maize
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
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The authors thank Davy Opdenacker for technical assistance and photography. We greatly thank Dr. Annick Bleys for helpful suggestions to improve the manuscript. This work was financed by the Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS' from the Belgian Federal Science Policy Office, by the FWO grant G027313N and by the Agency for Innovation by Science and Technology, IWT (IR).

1. Arabidopsis Lris protocollo Nota: Il testo fa riferimento a &quot;piccoli&quot; o &quot;grandi&quot; esperimenti scala. Esperimenti su scala ridotta, come l&#39;analisi linea marcatore e colorazione istologica 6, 14, richiedono solo un paio di esempi. Esperimenti su vasta scala, come quantitativa real-time qRT-PCR, microarray 9-11 o RNA sequencing, richiedono una maggiore quantità di campioni. In quanto tale, un importo pari a ~ 1000 piantine per campione è stato utilizzato da Vanneste et al. 11 per eseguire esperimenti di microarray dopo segmento radice dissezione. GIORNO 1 <ol><li> Sterilizzazione di Arabidopsis Seeds Nota: selezionare una delle seguenti procedure per la sterilizzazione del seme. Uno di essi è adatto per le prossime fasi del protocollo. Sterilizzazione a gas (1.1.2) presenta due vantaggi principali rispetto sterilizzazione liquida (1.1.1): ci vuole meno tempo quando si maneggia una grande intorpiditoer di semi, poiché nessuna pipettaggio deve verificarsi per i singoli campioni; ei semi sterilizzati possono essere conservati per un periodo più lungo. Tuttavia, esso richiede un essiccatore e accurato trattamento. <ol><li> Sterilizzazione liquido <ol><li> Versare il numero desiderato di semi in tubi di micro-centrifuga. Utilizzare fino a 20 mg (~ 800 semi) in una provetta da 1,5 ml o 40 mg (~ 1600 semi) in 2 ml provette micro-centrifuga. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. Invertire o scuotere delicatamente per 2 minuti. </li><li> Sostituire l&#39;etanolo al 70% con 1 ml di soluzione di sterilizzazione per 15 min. (Preparare la soluzione di sterilizzazione fresco: 3,85 ml di ipoclorito di sodio (NaOCl) stock (12%) (ATTENZIONE: l&#39;utilizzo fumi cappa), 5 ml Tween 20, fino a 10 ml con acqua invertire i tubi diverse volte per assicurarsi che tutti i semi arrivano. in contatto con la soluzione. </li><li> In una cappa a flusso laminare, sostituire la soluzione di sterilizzazione con 1 ml di acqua distillata sterile e sciacquare i semi 5 volte per 5 min da ripetutily sostituzione con 1 ml di acqua distillata sterile fresca. </li></ol></li><li> Sterilizzazione Gas <ol><li> Versare il numero desiderato di semi in un tubo da centrifuga micro-2 ml. Utilizzare singoli tubi quando si lavora con più linee indipendenti, e disporli aperti in una scatola tubi micro-centrifuga di plastica o di supporto. Se il numero di semi in un tubo supera 500 (12,5 mg), suddividere i semi al numero appropriato di provette per assicurare sterilizzazione. Assicurarsi che i tappi di tubi adiacenti non coprono l&#39;un l&#39;altro. Montare insieme il coperchio della scatola sul fondo, in quanto deve essere nell&#39;essiccatore anche per la sterilizzazione. </li><li> Posizionare la scatola nella ciotola di un essiccatore, insieme a un bicchiere di vetro (ATTENZIONE: l&#39;utilizzo dei fumi cappa). </li><li> Riempire il bicchiere con 100 ml di 12% NaOCl (ATTENZIONE: Utilizzare cappa). Mettere il coperchio sulla essiccatore, ma lasciare una piccola apertura in cui è collocato il bicchiere. </li><li> Aggiungere 3 ml di acido cloridrico 37% (fumigante) (CAUZIONE: Usa fume hood) al bicchiere attraverso la piccola apertura e chiudere rapidamente un essiccatore. La volontà bolla soluzione per qualche tempo a causa di Cl formazione 2 -gas. Lasciare il sistema chiuso O / N (o almeno 8 ore). </li><li> Togliere il coperchio del essiccatore. Estrarre la scatola e coprire con il coperchio per evitare la contaminazione durante il trasporto. </li><li> Mettere la scatola in un armadio flusso laminare, togliere il coperchio e lasciare i semi per circa 1 ora a temperatura ambiente per permettere la fuoriuscita di gas. Nota: I semi possono essere secca in tubi di micro-centrifuga chiusi conservati in modo sicuro fino a 2 settimane a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Laterale induzione Root in Arabidopsis <ol><li> Laterale Root inibizione (NPA Treatment) <ol><li> Preparare il terreno di coltura per la crescita in vitro. Il terreno contiene metà forza Murashige e Skoog miscela di sale 15, 0,1 g / L mio-inositolo, 10 g / L di saccarosio, ed è tamponata con 0,5g / L 2- (N-morfolino) Acido etansolfonico (MES). </li><li> Regolare il pH a 5,7 con 1 M KOH. Aggiungere 8 g / L di agar pianta tessuto e il mezzo autoclave per 20 minuti a 121 ° C. </li><li> Preparare una soluzione madre 25 mm di NPA in dimetilsolfossido (DMSO) (ATTENZIONE: Indossare guanti). In una cappa a flusso laminare, raffreddare il mezzo autoclavato fino a circa 65 ° C (che è la temperatura a cui la bottiglia può essere tenuto a mano), e aggiungere 25 soluzione madre NPA mM per ottenere una concentrazione finale di 10 pM NPA. </li><li> Omogeneizzare su oltre agitando delicatamente il flacone per 10 secondi. Versare 50 ml di terreno per ogni piatto quadrato di Petri (12 cm x 12 cm). Nota: In caso di esperimenti su larga scala, applicare una rete di nylon (20 micron) per assicurare un facile trasferimento. Preparare una maglia (9 cm x 9 cm) per la sterilizzazione in autoclave (Figura 1A). Quando autoclave, applicare la rete al mezzo di crescita con una pinzetta sterile (Figura 1B). Spingere delicatamente la maglia al mezzo di crescita con una sterilized drigalsky per assicurarsi che sia in buon contatto con il mezzo di crescita (Figura 1B) (ATTENZIONE: Il lavoro in condizioni sterili). </li><li> Seminare i semi sui NPA piastre. Nota: Nel caso in cui è previsto un esperimento su larga scala, seminare 2 file densi e ben allineati di 50 semi di facilitare il prelievo (vedi 1.2.2.3). <ol><li> In caso di sterilizzazione liquido, seminare i semi su NPA-lastre con una pipetta 200 l. Tagliare 3 - 4 mm dalla fine delle punte di pipettaggio in condizioni sterili (o prima della sterilizzazione delle punte) per poter pipettare i semi. Pipettare su e giù un paio di volte a ri-sospendere i semi, poi pipettare acqua circa 150 microlitri sterile con 10 - 20 semi e aspettare che il sedimento semi sul fondo della punta. (ATTENZIONE: Il lavoro in condizioni sterili) Nota: Toccando l&#39;agar o mesh delicatamente con la punta, una goccia d&#39;acqua con un seme sarà rilasciato da esso (Figura 1C). </li> &lt;li&gt; In caso di sterilizzazione a gas, seminare i semi con autoclave toothpicks.Pinch la stuzzicadenti nel agar prima di prendere i semi per garantire una superficie adesiva. Raccogliete la semi uno a uno con lo stuzzicadenti e distribuire i semi sulle piastre (Figura 1D). In alternativa, aggiungere acqua sterile per i semi, e di seminare come descritto in 1.2.1.5.1 (ATTENZIONE: Il lavoro in condizioni sterili). </li></ol></li><li> Sigillare le piastre con nastro adesivo traspirante e memorizzarli piastre a 4 ° C al buio per almeno 2 giorni e massimo una settimana. Questo è necessario per stratificazione e garantisce sincronizzati e germinazione più efficiente. Nota: In alternativa, i semi possono essere stratificati prima della semina, immerse in acqua distillata in tubi micro-centrifuga, che richiede meno spazio frigorifero. In questo caso, conservare le provette per almeno una settimana a 4 ° C, e spostare le piastre al mobile crescita subito dopo la semina (vedi 1.2.1.7). GIORNO 3 </li&gt; <li> Spostare le piastre al mobile crescita (luce continua (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) per 5 giorni (2 giorni di germinazione e 3 giorni di crescita) in posizione quasi verticale (80 a 90 °) per assicurare la crescita delle radici, e non nel mezzo. GIORNO 8 </li></ol></li><li> Laterale Root induzione (NAA Treatment) <ol><li> Preparare lo stesso terreno di coltura come descritto in 1.2.1.1 e 1.2.1.2. Preparare una soluzione 50 mM magazzino di NAA in DMSO (ATTENZIONE: Indossare guanti). Raffreddare il terreno autoclavato fino a 65 ° C e aggiungere la soluzione NAA al mezzo per ottenere una concentrazione finale di 10 mM NAA (NOTA: Il lavoro in condizioni sterili). <ol><li> Omogeneizzare su oltre agitando delicatamente il flacone per 10 secondi. Versare 50 ml di terreno per ogni piatto quadrato di Petri (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> Trasferire le piantine dalle piastre contenenti terreno di coltura supplementato con 10 micron NPA a quelli supsere realizzata con 10 micron NAA. <ol><li> Agganciare le braccia di pinzette ricurve sotto i cotiledoni della piantina e rimuoverla delicatamente dalla piastra. Trasferire solo piantine le cui radici sono cresciuti completamente in contatto con il mezzo NPA-crescita e preferibilmente verso il basso. </li><li> Skim la radice nel medio di crescita della superficie-NAA che contiene oltre una piccola distanza. Assicurarsi che le radici delle piante sono in buon contatto con il mezzo di crescita. Se necessario, premere il radice delicatamente sulla superficie terreno di coltura con le pinzette. Nota: Nel caso di un grande esperimento, rimuovere tutti piantine che non sono in contatto con la rete e trasferimento sollevando la mesh ai due angoli superiori con pinzette. Assicurarsi che la maglia è in buon contatto con il mezzo-NAA contenente schiumando maglia sulla superficie agar su una piccola distanza (Figura 1E). </li></ol></li><li> Sigillare le nuove piastre con nastro adesivo traspirante e metterli nel quadro di crescita (conluce continuo (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) in posizione verticale per il tempo desiderato dopo induzione fino al campionamento. Nota: Nel caso di un grande esperimento, utilizzare un bisturi per tagliare i segmenti radice tutti in una volta direttamente sulla maglia e campionare raschiando delicatamente la superficie della mesh. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Lris mais protocollo <ol><li> Stratificazione di mais kernel <ol><li> Incubare i chicchi di mais a 4 ° C al buio per almeno 1 settimana. Nota: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando la linea inbred di mais B73. </li></ol></li><li> Sterilizzazione di mais kernel GIORNO 1 Nota: Anche se piante di mais non devono essere coltivate in condizioni di sterilità, si consiglia di sterilizzare i chicchi di mais e di lavorare con materiale sterile per prevenire la crescita di funghi nel rotolo di cartasistema. <ol><li> Mettere il numero necessario di chicchi di mais in un bicchiere di vetro sterilizzati. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di sterilizzazione (6% NaOCl in acqua) (ATTENZIONE: l&#39;utilizzo cappa). </li><li> Aggiungi un ancoretta magnetica e posizionare il bicchiere su un agitatore magnetico a bassa velocità di agitazione (circa 250 giri al minuto) a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Risciacquare cinque volte per 5 min, sostituendo la soluzione con 100 ml di acqua fresca sterile. </li></ol></li><li> La semina mais kernel <ol><li> Indossare guanti per ridurre il rischio di contaminazione, e prendere un rotolo di carta assorbente. </li><li> Strappare due tratti di mano un tovagliolo di carta con una lunghezza totale di due fogli (circa 92 centimetri x 24 cm) e metterli uno sopra l&#39;altro su una superficie pulita (Figura 2A). </li><li> Piegare i fogli raddoppiare la lunghezza (circa 92 cm x 12 cm) (Figura 2A). </li><li> Utilizzare le pinzette per distribuire 10 kernel a circa 2 cm dalla parte superiore su tegli intera lunghezza della carta, mantenendo un&#39;intercapedine di 8 cm tra ogni kernel e 8 cm connessione alle due estremità (Figura 2B). Assicurarsi che la radichetta del kernel sia rivolta verso il basso e verso la carta (Figura 2B). </li><li> Rotolare delicatamente la carta su tutta la lunghezza, pur mantenendo i semi in sede (Figura 2B). Per facilitare il rotolamento, è facoltativo spruzzare prima la carta con acqua sterile. </li><li> Mettere i rotoli di carta in tubi di vetro sterilizzati di circa 6 cm di diametro e 14 cm di altezza (per esempio, 250 ml provette centrifuga) e metterli in un rack (Figura 2C). </li></ol></li><li> Laterale induzione Root in mais <ol><li> Preparare una soluzione al 50 NPA mM magazzino (disciolto in DMSO) (ATTENZIONE: Indossare guanti). </li><li> Per ogni tubo, fare una soluzione al 50 micron NPA aggiungendo 125 microlitri della soluzione madre 50 NPA mM a 125 ml di acqua sterile, in un bicchiere di vetro sterilizzati. </li><li> Mescolare bene eversare 125 ml di soluzione 50 mM NPA sopra il rotolo di carta nel tubo. Il rotolo di carta in grado di assorbire la soluzione e diventare completamente assorbito. Nota: Quando si utilizzano rotoli di carta e tubi con altre dimensioni, regolare il volume di conseguenza. Il liquido dovrebbe raggiungere a metà strada del tubo per assicurare l&#39;assorbimento sufficiente. </li><li> Collocare il sistema rotolo di carta in un armadio di crescita per tre giorni (27 ° C, luce continua, il 70% di umidità relativa). Assicurarsi che i rotoli di carta rimangono impregnati con l&#39;aggiunta extra di 50 micron soluzione NPA, dal momento che la soluzione evapora nel tempo (Figura 2D). GIORNO 4 </li><li> Preparare una soluzione al 50 NAA mM magazzino (disciolto in DMSO) (ATTENZIONE: Indossare guanti). </li><li> Per ogni tubo, preparare una soluzione NAA 50 micron con l&#39;aggiunta di 125 microlitri dal magazzino 50 NAA mM a 125 ml di acqua sterile in un bicchiere di vetro sterilizzati. </li><li> Premere delicatamente la maggior parte della rimanente soluzione di NPA dai rotoli di carta e posizionare ilm di acqua sterile per 5 minuti per lavare fuori (ATTENZIONE: Indossare guanti). Spremere delicatamente la maggior parte dell&#39;acqua dai rotoli di carta. Ripetere questa operazione di lavaggio per tre volte. </li><li> Mescolare bene e versare la soluzione NAA 50 micron sui rotoli di carta nei tubi. Assicurarsi che siano completamente immersi. </li><li> Posizionare il sistema rotolo di carta nel gabinetto crescita (27 ° C, luce continua, 70% di umidità relativa) per la durata desiderata dopo induzione. </li></ol></li><li> Laterale induzione Root in accidentale Corona Roots of Maize Nota: Il Lris come descritto sopra induce radici laterali nella radice primaria. Tuttavia, nel mais e altre monocotiledoni, la radice primaria e le radici seminali embrionali, insieme con le loro radici laterali, sono principalmente importante durante lo sviluppo piantina. In una fase successiva della crescita delle piante, le radici avventizie postembrionali sorgono sullo stelo e anche sviluppare radici laterali per formare un nuovo sistema di radice 16. Il Lris può anche essere utilizzatod per indurre radici laterali su queste post-embrionali radici avventizie corona seguendo alcuni piccoli aggiustamenti alla Lris sulla radice primaria embrionale. <ol><li> Per rendere i rotoli di carta, creare un sandwich di carte con rispettivamente due strati di mano tovagliolo di carta sul lato esterno, e due strati di carta all&#39;interno di germinazione. Posizionare i kernel sterilizzati (vedere i passi 2,1-2,2) tra i due fogli di carta germinazione. Carta germinazione, rispetto alla carta asciugamani, sarà meno incline ad essere penetrato da peli radicali e radici laterali, che renderà l&#39;apertura del rotoli di carta più facile in seguito. D&#39;altra parte, i due strati esterni di asciugamano di carta saranno facilitare l&#39;assorbimento del liquido. </li><li> Inserire i rulli in 700 ml di tubi di vetro e versare acqua sterile senza NPA su di loro. Assicurarsi che siano completamente immersi. </li><li> Germinare i chicchi sterilizzati nell&#39;armadio di crescita (vedi punto 2.4.9). </li><li> Crescere le piante fino alle radici avventizie coronainiziare ad emergere (6 giorni per B73). Assicurarsi che i rotoli di carta sono tenute umido in ogni momento con l&#39;aggiunta di acqua sterile quando necessario. </li><li> Trasferimento a una soluzione 25 mM NPA per 4 giorni (vedi i punti 2.4.1 a 2.4.4), seguita da una simile induzione di apertura laterale radice sostituendo la soluzione con una soluzione NPA NAA 50 pM dopo una fase di lavaggio (vedi passo 2.4 0,5 a 2.4.9). </li></ol></li></ol>

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M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings.">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li><li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethylene+on+uptake,+distribution,+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C.">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li><li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2,4-dichlorophenoxy+acetic+acid,+naphthalene-1-acetic+acid,+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells.">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li><li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgenomics:+genome-scale,+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers.">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li><li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor.">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel protocollo Arabidopsis Lris, è importante trasferire solo le piantine che sono cresciuti completamente in contatto con il terreno di coltura contenente NPA. Questo assicura che laterale iniziazione radice è bloccato su tutta la lunghezza della radice. Al fine di prevenire il ferimento di piantine durante il trasferimento, le braccia delle pinze curve possono essere agganciati sotto i cotiledoni della piantina. Al trasferimento, assicurarsi che le radici di piantine sono in contatto sufficiente con il terr...

Il sistema radicale è cruciale per la crescita delle piante, in quanto garantisce l&#39;ancoraggio e l&#39;assorbimento di acqua e nutrienti dal terreno. Poiché l&#39;espansione di un sistema radicale si basa principalmente sulla produzione di radici laterali, la loro iniziazione e formazione sono stati ampiamente studiati. Radici laterali sono iniziati in uno specifico sottogruppo di cellule pericycle, chiamate cellule fondatore 1. Nella maggior parte delle dicotiledoni, come Arabidopsis thaliana, queste cellule si trovano ai poli protoxylem 2, mentre in monocotiledoni, come il mais, si trovano ai poli floema 3. Fondatore cellule sono caratterizzati da un aumento della risposta auxina 4, seguita dalla espressione di specifici geni del ciclo cellulare (ad esempio, CYCLIN B1; 1 / CYCB1; 1), dopo di che subiscono un primo giro di asimmetrici divisioni anticlinali 5. Dopo una serie di divisioni anticlinali e periclinal coordinati, un primordio radice laterale è formata che finalmente emergerà come unradici laterali utonomous. La posizione e la tempistica di apertura laterale root non sono comunque prevedibile, poiché questi eventi sono né abbondanti né sincronizzato. Questo impedisce l&#39;utilizzo di approcci molecolari, come trascrittomica per studiare questo processo. Per affrontare questo, una laterale Root inducibile System (Lris) è stato sviluppato 6, 7. In questo sistema, piantine vengono prima trattati con acido N -1-naphthylphthalamic (NPA), che inibisce il trasporto e l&#39;accumulo di auxina, bloccando di conseguenza laterali iniziazione radice 8. Con successiva cessione delle piantina di terreno contenente l&#39;auxina sintetico acido acetico 1-naftalene (NAA), l&#39;intero strato pericycle risponde ai livelli di auxina elevati così massicciamente che inducono alla radice l&#39;avvio divisioni cellulari laterali 6. Come tale, questo sistema porta a veloci, sincroni ed estese radici laterali iniziazioni, che consente un facile prelievo di campioni di radice arricchito da una determinata fase di ritardolo sviluppo delle radici ral. Successivamente, questi campioni possono essere utilizzati per determinare profili di espressione a livello di genoma durante la formazione delle radici laterali. Il Lris ha prodotto conoscenze già significativo circa iniziazione laterale radici in Arabidopsis e mais 9-13, ma la necessità di applicare questo sistema per altre specie di piante diventa più evidente quanto più genomi sono in sequenza e non vi è un interesse crescente per trasferire la conoscenza a economico importante specie. Qui, sono indicati i protocolli dettagliati della Arabidopsis e mais LRISs. Successivamente, un esempio di utilizzo del sistema è fornito, illustrando come trascrittomica dati ricavati dal mais Lris possono essere utilizzati per identificare omologhi funzionali che hanno una funzione conservata durante l&#39;inizio radice laterale attraverso diverse specie vegetali. Infine, le linee guida per ottimizzare il Lris sono proposti per altre specie vegetali.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ARABIDOPSIS LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gas sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>glass desiccator</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic micro-centrifuge tubes box or holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%</td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog salt mixture</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Sucrose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Making a mesh for transfer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Synthetic nylon mesh 20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square petri dish plates</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN tubes</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&amp;nbsp;50 ml centrifuge tubes</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cut pipette tips</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving</td></tr><tr><td>breathable tape&amp;nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth room</td><td></td><td></td><td>21 &amp;deg;C, continuous light</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MAIZE LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maize kernels</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of kernels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetic stirrer&amp;nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &amp;micro;M (maize primary root), 25 &amp;micro;M (maize adventitious root)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &amp;micro;M (maize)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paper hand towels</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>seed germination paper</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# seed germination paper</td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (centrifuge) tubes</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml tubes</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylinders, round foot tube, D 60&amp;nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>for maize tubes, home made</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth cabinet</td><td></td><td></td><td>27 &amp;deg;C, continuous light, 70% relative humidity</td></tr></tbody></table>

lateral root inducible system in arabidopsis and maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Applicazione del Lris per eseguire Trascrittomica comparativi del processo laterale Root Iniziazione Un&#39;applicazione della Lris è il confronto e correlazione dei profili di espressione genica durante la formazione delle radici laterali in specie diverse. Trascrittomica comparata approcci creare la possibilità di individuare i geni ortologhi coinvolti nel processo di sviluppo delle radici laterali in dive...

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Sistema inducibile della radice laterale nell'Arabidopsis e nel mais | Biologia | Video

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Laterale Root inducibile di sistema in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E mais

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

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Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

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13.7K Views.  Ghent. The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

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Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Il disegno sperimentale per Microdissezione laser RNA-Seq: Lezioni da una analisi dello sviluppo di mais Leaf

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Ricerca

Biochimica

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Genetica

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

La lignina down-regulation dei<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi e Klason lignina analisi

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Bioingegneria

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Ambiente

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Biologia dello sviluppo

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Biologia

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Luce Foglio microscopia a fluorescenza delle radici delle piante che crescono sulle superficie di un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Induzione e rigenerazione delle radici pelose mediate da agrobatteri nelle piante

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dei protocolli di trasformazione basati sulle radici pelose per una maggiore efficienza nelle Brassicaceae

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Laterale Root inducibile di sistema in

Riepilogo

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