L'innesto di semina in fase iniziale è un potente strumento per impostare la segnalazione a lunga distanza nelle piante. Speriamo che questo metodo aiuti nell'adozione di successo dell'innesto di semina senza formazione pratica. Inizia preparando la capsula di Petri quadrata, che misura 100x100 millimetri per la fusione dell'elastomero siliconico.
Prendi il filo calibro 29 in fascette a torsione dopo aver rimosso il rivestimento esterno di carta sul filo con acetone. E raddrizzare completamente il filo facendolo rotolare su una superficie dura e uniforme con un oggetto piatto pesante, come un rack di tubi metallici. Quindi, posare quattro pezzi di fili raddrizzati equidistanti l'uno dall'altro nella piastra di Petri quadrata, assicurandosi che i fili giacciono piatti sul fondo del piatto.
Versare la soluzione mista di elastomero di silicio sopra i fili nella piastra di Petri e posizionare il coperchio sul piatto. Dopo aver lasciato polimerizzare il silicone per 24-48 ore a temperatura ambiente, rimuovere il foglio di silicone dalla piastra di Petri con una pinza pulita e spostarlo su una superficie pulita e piana. Rimuovere i fili dal foglio di silicone.
Per garantire che i canali siano aperti su un lato, utilizzare una pinza a punta fine per eliminare il sottile strato di silicone che blocca il lato aperto dei canali. Tagliare il foglio di silicone perpendicolare ai canali in strisce di tre millimetri usando forbici pulite. Posizionare ogni striscia in una busta di alluminio e sigillarla con nastro adesivo.
Autoclavare le strisce a 121 gradi Celsius per almeno 30 minuti prima di riporle fino al momento del bisogno. Per sterilizzare e vernalizzare i semi, prendere un millilitro di soluzione di candeggina al 50% contenente 0,1% Tween 20 in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri e sospendere fino a 100 semi di arabidopsis in esso. Incubare la sospensione del seme a temperatura ambiente per cinque a 10 minuti.
Dopo l'incubazione, aspirare o pipettare la soluzione di candeggina in condizioni sterili. Risciacquare i semi con un millilitro di acqua distillata sterilizzata. Assicurati di capovolgere adeguatamente i tubi durante il risciacquo dei semi.
Per rimuovere qualsiasi soluzione di candeggina rimasta nella parte superiore del tubo, ripetere il risciacquo quattro volte. Lasciare circa 250 microlitri di acqua con i semi nel tubo e conservare i semi al buio a quattro gradi Celsius per tre giorni. Successivamente, prima di placcare i semi, posizionare le strisce sterili sulla superficie della piastra MS preparata per guidare l'allineamento del seme con i canali sulle strisce.
Quindi, lavorando in condizioni sterili, utilizzare una punta di pipetta da 20 microlitri per aspirare e trasferire il numero appropriato di semi preparati sulla piastra. Una volta che i semi sono placcati, rimuovere le strisce sterili. Coprire il piatto.
E sigillare uno dei lati del piatto parallelo alle file di semi con parafilm. Avvolgere del nastro traspirante sulla parte superiore del parafilm e attorno a tutti gli altri bordi della piastra per consentire il ricambio d'aria durante l'incubazione. Orientare con cura due piastre verticalmente con i lati sigillati con parafilm rivolti verso il basso.
Separarli nella parte inferiore posizionando orizzontalmente un tubo di centrifuga da 15 millilitri in mezzo, fissandoli insieme sulla parte superiore con un elastico. Assicurarsi che le superfici delle piastre formino un angolo compreso tra 100 e 110 con la superficie del piano di lavoro. Conservare le piastre in questo orientamento per 72 ore nell'oscurità totale a 21 gradi Celsius per consentire agli ipocotili delle piantine di crescere di circa cinque millimetri di lunghezza.
Dopodiché, rimuovere la configurazione dal buio e tenerla sotto un ciclo di luce di 16 ore e buio di otto ore per due o quattro giorni alla stessa temperatura prima dell'innesto. Innesare le piantine tra cinque e sette giorni dopo essere state placcate. Posizionare una striscia di innesto sulle piantine, adattando i loro ipocotili nei canali.
Posizionare delicatamente la piantina, in modo che la giunzione radice-ipocotile rimanga sul fondo della striscia di silicone per preparare la piantina per il taglio. Lavorando in un cappuccio sterile con l'aiuto di un cannocchiale di dissezione, preparare i rampolli per l'innesto. Usando una lama di bisturi fresca, fai un taglio dritto, pulito e perpendicolare attraverso l'ipocotile.
Evitare di premere verso il basso e spingere la piantina nell'agar. Quindi, rimuovere lo scivolo e mantenere idratata la parte tagliata dello scivolo assicurando il contatto con la superficie del supporto. In alternativa, lo scivolo può essere spostato in una capsula di Petri riempita con acqua distillata sterile.
Per preparare i portinnesti, afferrare con cura la radice all'interno dello spazio tra le pinze chiuse e girare delicatamente per tirarla, lasciando la sezione tagliata dei portainnesti al centro della striscia. Quindi, raccogliere delicatamente lo scivolo desiderato usando la pinza a punta fine e inserirlo nella parte superiore del canale. Visivamente, confermare il contatto tra il rampollo e il portainnesto per ottenere un innesto di successo.
Dopo che tutti gli innesti sono stati fatti, avvolgere le piastre con parafilm e nastro traspirante e impostare le piastre nello stesso modo in cui è stato dimostrato in precedenza senza disturbare le piantine o le strisce di silicone. Spostare con attenzione le piastre in una camera di crescita impostata a 26 gradi Celsius con un ciclo di luce di 16 ore e buio di otto ore. Dopo sette-10 giorni, valutare le piantine innestate in condizioni sterili utilizzando una pinza per staccare accuratamente la striscia di silicone da un lato e liberare le piantine dai canali.
Rimuovere eventuali radici avventizie che crescono dal rampollo tagliandole con una lama di bisturi fresca o schiacciandole con una pinza a punta fine. Ancora una volta, valutare visivamente se il portainnesto è diventato saldamente attaccato al rampollo formando un innesto di successo. Spostare gli innesti di successo nel terreno di propagazione della piantina e coprire il terreno con plastica trasparente per alcuni giorni mentre le piantine si stabiliscono.
Lascia che le piante crescano sotto i cicli di luce e buio precedentemente menzionati a 21 gradi Celsius. Le prove di innesto per determinare il protocollo di innesto ottimale hanno rivelato un tasso di successo complessivo dell'innesto del 25% quando i semi germinavano direttamente sulle strisce di silicone con canali chiusi. Riorientando i semi per mantenere i cotiledoni degli embrioni e il radicale rivolto verso il basso durante la germinazione ha aumentato leggermente l'efficienza dell'innesto al 33%Dopo aver rimosso la chiusura del silicone sui canali per consentire il contatto tra il seme e il terreno di crescita, l'85% delle piantine ha germinato con successo.
Tuttavia, il tasso di successo dell'innesto è rimasto al 31%, indicando che la crescita ottimale della piantina non poteva essere raggiunta con la germinazione on-strip. È interessante notare che il protocollo dimostrato in cui le piantine sono state coltivate verticalmente sulla piastra di innesto prima di essere inserite nei canali aperti nelle strisce ha prodotto un tasso complessivo di successo dell'innesto al 48% durante i primi due studi. Considerando il tasso di successo inferiore del terzo e lo studio relativamente piccolo, che può essere attribuito a lievi variazioni nei siti di innesto, il successo complessivo dell'innesto è risultato essere del 45% Questo è paragonabile al metodo in cui le piantine sono state coltivate su piastre orizzontali, tagliate su una superficie solida e inserite in strisce di innesto.
Tuttavia, il protocollo dimostrato è relativamente meno dispendioso in termini di tempo. Utilizzando questo protocollo, i laboratori nuovi all'innesto di piantine possono creare rapidamente un gran numero di dispositivi di supporto per l'innesto, pur essendo in grado di personalizzare facilmente il dispositivo per soddisfare facilmente le loro esigenze specifiche.
