Questa tecnica può identificare in modo efficiente il genotipo S e identificare con precisione l'autoincompatibilità degli agrumi, fornendo le informazioni necessarie per la selezione di alberi impollinatori adatti. Questa è una tecnica efficiente in termini di tempo, semplice e affidabile per selezionare gli alberi genitori appropriati nei programmi di allevamento. Questa tecnica è semplice e facile da fare e fare esperimenti per la prima volta richiede pazienza e cura.
L'identificazione del genotipo S e la progettazione del primer S-specifico richiedono maggiore attenzione e cura. A dimostrare la procedura sarà Yu Hu, uno studente laureato del mio laboratorio. Inizia la raccolta del polline portando il pomelo Majia, Citrus maxima, fiori al laboratorio.
Raccogliere le antere usando una pinzetta e metterle in una piastra di Petri contenente carta da filtro. Asciugare i granelli di polline mettendo la capsula di Petri contenente le antere in un forno a 28 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'essiccazione, conservare il polline in un sacchetto ermetico con chiusura a zip Micro Centron contenente gel di silice che cambia colore.
Chiudere il sacchetto ed etichettarlo con il nome della varietà di polline e la data di conservazione. Versare 300 microlitri del mezzo liquido nel tappo di un tubo da centrifuga da due millilitri e cospargere il polline in modo uniforme con l'aiuto di un pennello per impollinazione. Mettere il polline in una scatola nera umidificata e incubare a 28 gradi Celsius per 12 ore.
Dopo l'incubazione, tagliare la punta superiore di un millimetro da una punta di pipetta da 1.000 microlitri e aspirare il polline con una piccola quantità di soluzione di coltura. Posizionare il polline al centro del vetrino del microscopio e coprirlo con un vetrino di copertura. Una volta fatto, osservare il campione con un microscopio invertito utilizzando un obiettivo 10X.
Eseguire tre repliche indipendenti utilizzando approssimativamente la stessa densità di polline per ogni replica. Per l'impollinazione, utilizzare un pennello per l'impollinazione per diffondere una quantità sufficiente di polline vitale sulla superficie dello stigma, assicurandosi di non danneggiare il pistillo. Coprire i fiori impollinati con un sacchetto di carta solfato e prevenire l'impollinazione da pollini genotipicamente distinti sigillando il sacchetto con una graffetta.
Scrivi il nome della specie e il numero e il tempo di impollinazione sull'etichetta. Appendere l'etichetta sui rami vicino ai fiori impollinati. Rimuovere i sacchetti di impollinazione circa tre o quattro giorni dopo l'impollinazione e raccogliere i fiori impollinati in sacchetti con chiusura a zip.
Rimuovere immediatamente i petali, i recipienti e le ovaie dai fiori e immergere lo stigma fuso per modellare in un tubo di centrifuga contenente una soluzione fissativa appena preparata. Incubare lo stigma e lo stile nella soluzione fissativa durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, scartare la soluzione fissativa prima di lavare lo stigma e modellare due o tre volte in etanolo al 95%.
Quindi, aggiungere una soluzione di etanolo al 70% allo stile, assicurandosi che il campione sia completamente immerso nella soluzione. Gli stili in questa fase possono essere conservati a quattro gradi Celsius per uno o due mesi. Per la colorazione blu all'anilina, lavare i campioni di stile conservati in etanolo al 70% con acqua distillata tre o quattro volte.
Immergerlo in una soluzione di idrossido di sodio a quattro molari e sigillarlo prima di incubarlo in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per 60 minuti. Durante questa fase, il colore dello stile cambia da giallo-bianco a rosso-arancio. Quindi, immergere gli stili in acqua distillata.
Dopo 30 minuti, scartare l'acqua distillata e lavare gli stili con acqua distillata tre o quattro volte o fino a quando il colore dello stile diventa giallo. Quindi, aggiungere il blu di anilina fino a quando il campione è immerso e incubare per 12 ore al buio. Osservare la crescita del tubo pollinico al microscopio a fluorescenza.
Posizionare la diapositiva su un tavolo piano. Dividi lo stile in due metà lungo l'asse longitudinale usando un bisturi. Posizionare metà dello stile su un vetrino e aggiungere due o tre gocce di glicole polietilenico sulla superficie del vetrino.
Quindi, coprirlo con un foglietto di copertura. Una volta fatto, posizionare il vetrino sul palco del microscopio sopra l'apertura e visualizzare utilizzando un obiettivo 10X. Utilizzare il filtro DAPI e osservare la crescita del tubo pollinico.
Osserva cinque stili per ogni tipo di impollinazione. La vitalità del polline di Citrus maxima e i tassi di germinazione sono stati quantificati utilizzando la microscopia fluorescente. Il polline compatibile è germogliato con successo sulla superficie dello stigma e ha prodotto un tubo pollinico normale, che è cresciuto e alla fine ha portato alla fecondazione nell'ovaio.
Al contrario, i tubi pollinici incompatibili sono cresciuti attraverso circa 2/3 dello stile e poi hanno smesso di crescere. L'elettroforesi su gel di agarosio ha rilevato il prodotto del DNA amplificato utilizzando i primer specifici del locus S. Ha mostrato l'amplificazione del prodotto del DNA tra 500 e 1.000 coppie di basi.
È stato identificato il genotipo S corrispondente. Con questo metodo sono stati identificati 21 aplotipi S in diverse specie di agrumi. La fase di impollinazione è fondamentale.
Solo l'impollinazione di successo può garantire la successiva osservazione dei tubi pollinici. La tecnica è stata utilizzata per analizzare i tratti di auto-incompatibilità e per esplorare e identificare le determinanti femminili dell'auto-incompatibilità. Questo metodo è importante per la ricerca sull'auto-incompatibilità e i programmi di allevamento.
Può anche facilitare la comunità agricola per la selezione di alberi impollinatori per i loro frutteti.
