Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte provengono dalla membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti estendiamo il nostro più caloroso ringraziamento e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915), e l&#39;Università di Limerick.

Un focus importante nel campo della biologia strutturale e funzionale è la membrana biologica (Figura 1). La membrana che avvolge il cellulare e subcellulare organelli quando presente, è una struttura molecolare sottile appena due molecole lipidiche tutta ed è costellata di proteine. Struttura e funzione applicata ad entrambi lipidi e le proteine ​​sono di interesse. Tuttavia, il focus di questo articolo è limitato alle proteine ​​di membrana. Una migliore comprensione di come le proteine ​​di membrana funzione a livello molecolare è richiesta per due motivi. In primo luogo, vi è la soddisfazione intellettuale nel sapere come funzionano. In secondo luogo, sapendo come una proteina funziona, c&#39;è sempre la prospettiva di essere in grado di risolvere il problema dovesse funzionare male o di migliorare o addirittura modificarlo per applicazioni particolari. Progettazione di farmaci è un risultato evidente di questo tipo di lavoro. Un approccio per capire come una proteina di membrana lavora a livello molecolare è quello di determinare la sua struttura. Si tratta di stabilire la posizione in 3-dimensionale spazio di tutti gli atomi, o almeno non tutti gli atomi di idrogeno, che costituiscono le proteine. Il metodo che usiamo a questo scopo è macromolecolare cristallografia a raggi X (MX). La Figura 2 mostra un esempio di una proteina di membrana la cui struttura è stata determinata utilizzando MX. Un cristallo di qualità diffrazione della proteina è necessario per MX. Chiaramente, ci sono molti passi coinvolti nella determinazione della struttura con la cristallografia macromolecolare. Questo è illustrato in Figura 3. In genere, questi includono l&#39;identificazione di un obiettivo proteina di membrana, e quindi la produzione, purificazione e cristallizzazione esso. Misure di diffrazione vengono eseguiti sul cristallo con una casa o una raggi X di sincrotrone fonte. I dati di diffrazione sono trattati producendo una mappa di densità elettronica che è poi dotato di un modello molecolare. Il modello, se raffinato, può essere utilizzato per esplorare il meccanismo d&#39;azione delle proteine ​​e per la struttura a base di progettazione di farmaci. Il focus di questo articolo è quello di mostrare come si produce cristalli di diffrazione di qualità delle proteine ​​di membrana con mesophases lipidico, con il cosiddetto metodo in meso. Una recente revisione del metodo e la sua portata è disponibile nella Guida di riferimento 1 (Caffrey, 2009). Il passo-passo protocollo seguiremo qui è descritto nella Guida di riferimento 2 (Caffrey e Cherezov, 2009). Un diagramma di flusso che riassume i passi necessari e il tempo necessario per l&#39;impostazione di un processo di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana meso è mostrata in Figura 4. Questo articolo riguarda quei passi racchiusa da linee tratteggiate rosse. Parte 1: Preparazione del Piastre cristallizzazione <ol><li> Posizionare un vetrino da microscopio silanizzata sul banco di lavoro. </li><li> Togliere il coperchio di protezione di carta da una superficie di una striscia di nastro perforato doppio bastone distanziatore (disponibile in commercio, vedi Tabella di reagenti e attrezzature specifiche di seguito). </li><li> Posizionare il, lato adesivo del nastro verso il basso, a contatto con la superficie del vetrino. </li><li> Pressione di tenuta del nastro alla diapositiva utilizzando un Brayer o un rullo. Foglio di alluminio può essere collocato tra il nastro e il rullo per proteggere la base dei pozzi. </li><li> Togliere il coperchio seconda carta dal nastro per esporre la sua superficie superiore appiccicosa. </li><li> Luogo coprioggetto singoli silanizzata in prossimità della piastra di sigillatura veloce ed efficiente dei pozzi non appena il caricamento è completo. </li></ol> Parte 2: Preparazione della siringa Lipid <ol><li> Posizionare il lipidi (spesso monoolein) in un blocco a temperatura controllata a 45 ° C per 3 minuti per renderlo fuso. </li><li> Mentre il lipidica si sta sciogliendo preparare due da 100 microlitri tenuta di gas siringhe Hamilton per l&#39;uso in lipidi-proteina fase di miscelazione. Rimuovere la ghiera in teflon dalla siringa che conterrà la soluzione proteica. Posizionare la siringa che conterrà i lipidi accanto ad esso (lasciando la ghiera in posizione). </li><li> Collegare l&#39;accoppiatore (vedi Tabella di reagenti e attrezzature specifiche di riferimento sotto e 3 (Cheng et al., 1998)) alla siringa lipidico. Serrare a mano l&#39;accoppiatore alla siringa, ma non stringere eccessivamente. Togliere lo stantuffo dal corpo della siringa lipidi. </li><li> Si noti che i lipidi devono essere fuse prima di procedere. Impostare la pipetta a 30 microlitri e lentamente occupano circa 30 ml di lipidi fuso. Lentamente fornire la maggior quantità di lipidi fuso, come si può in parte aperta della siringa avendo cura di non introdurre traferri. </li><li> Posizionare il pistone nel cilindro a contatto con il fuso lipidi e lentamente avanzare il pistone il cilindro con la siringa in posizione verticale, come dimostrato nel video. Bolle d&#39;aria che potrebbero essere intrappolati inavvertitamente dovrebbe aumentare nel processo ed essere rilasciato. </li><li> Con attenzione determinare il volume di lipidi nella siringa leggendo i segni sul corpo della siringa. </li><li> Far scorrere il FerrULE l&#39;ago si estende dal accoppiatore. Usa lo stantuffo per spingere la lipidico fuso il barile e lentamente e delicatamente l&#39;ago nel centro del giunto. </li></ol> Parte 3: Preparazione della siringa Proteine <ol><li> La soluzione di proteine ​​deve essere filata a 14.000 g per 5 a 10 minuti a 4 ° C per rimuovere grandi aggregati prima di impostare processi di cristallizzazione. Rimuovere la soluzione proteica dal ghiaccio e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente. </li><li> Calcolare il volume di soluzione proteica da utilizzare per formare la fase cubica in corrispondenza o nei pressi di idratazione completa. Per monoolein a 20 ° C, idratazione completa con acqua si verifica in% di acqua vicino a 40 (in massa), come nel diagramma di fase 5 (Figura 5). </li><li> Con una siringa da 25 o 50 microlitri Hamilton prendere il volume richiesto di soluzione proteica. Trasferire la soluzione sulla punta in Teflon del pistone nel cilindro della siringa proteina avendo cura di evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Attentamente l&#39;ago e misurare il volume di soluzione proteica nella siringa. Deve corrispondere al valore fornito nel passaggio precedente. </li><li> Lentamente pollici la soluzione proteica il barile per finire a filo con la sua estremità aperta. </li><li> Avvitare la siringa proteina nella estremità aperta del accoppiatore attaccato alla siringa lipidico. E &#39;fondamentale che il dispositivo non essere eccessivamente serrati. Un serraggio eccessivo del dispositivo assemblato di miscelazione in questa fase potrebbe danneggiare le boccole e causare perdite. Under serraggio porterà anche a perdite. </li></ol> Parte 4: Soluzione proteica e lipidica: Rendere il mesofase <ol><li> Per effetto di miscelazione, far avanzare il pistone sul lato proteina dell&#39;unità montata mescolando al suo limite, con il pollice o l&#39;indice guida la soluzione proteica fuori la siringa proteina, attraverso l&#39;accoppiatore e nella siringa lipidi. </li><li> Il pistone nella parte lipidica è ora utilizzato per guidare il contenuto della siringa lipidico indietro attraverso l&#39;accoppiatore e nella siringa proteine. </li><li> Il processo è ripetuto molte volte, occasionalmente, un centinaio di passaggi o più sono necessari per produrre un mesofase omogeneo. All&#39;inizio di miscelazione, il movimento di materiale avanti e indietro attraverso l&#39;accoppiatore può essere irregolare e, a volte, la forza supplementare è necessario per effettuare la miscelazione. Miscelazione iniziale è di solito accompagnata dallo sviluppo di una non uniforme nuvolosità nel campione. Come omogeneizzazione progredisce, il tessuto diventa più uniforme e caratteristico della fase viscoso cubi, così come l&#39;aspetto visivo del mesofase emergenti cubi. </li><li> Se le condizioni siano appropriati e le forme cubiche fase, la dispersione dovrebbe apparire otticamente trasparenti nel corpo della siringa. Così, i segni sul corpo della siringa deve essere chiaramente leggibili attraverso l&#39;mesofase nella canna. </li><li> Raffreddamento molto lieve del campione durante la miscelazione mettendo il mixer siringa per un breve periodo su ghiaccio può accelerare l&#39;omogeneizzazione e la realizzazione di trasparenza. Tuttavia, è importante non eccessivamente il campione. </li><li> Si deve prestare attenzione per evitare estremamente vigorosa miscelazione, in quanto ciò può causare temperatura del campione a salire a causa del riscaldamento attrito 3. </li></ol> Parte 5: Caricamento del Dispenser <ol><li> Rimuovere l&#39;ago e il pistone da un 10-microlitri siringa Hamilton. Lasciare la ghiera in teflon in posizione. </li><li> Rimuovere il dado di fissaggio dal distributore con l&#39;ausilio di una piccola moneta. </li><li> Con il braccio cricchetto completamente ritirato, inserire la siringa - senza il suo stantuffo e ago - attraverso l&#39;anello di sostegno del distributore. </li><li> Sostituire il dado, guarnizione laterale di fronte alla siringa, e avvitarla saldamente sull&#39;estremità aperta della siringa. Si deve prestare attenzione per assicurare la siringa sia correttamente centrata sul ring holding e che la canna è allineato parallelamente al braccio cricchetto. Entrambi possono essere giudicati da occhi. Questi due requisiti sono fondamentali per evitare perdite. </li><li> Passare il pistone attraverso l&#39;anello presa con il dado pinza svitato qualche giro e guida il pistone nella parte aperta della siringa. Premere il braccio cricchetto completamente. Muovere il pistone nel cilindro e controllare che viaggia liberamente e vero nella canna. Può essere utile per allentare la vite sulla barra di guida per facilitare lo stantuffo muoversi liberamente. Assicurarsi che lo fa. Spingere il pistone fino a quando la sua punta in teflon si allinea con la tacca di zero laurea microlitri sulla canna. Se la vite sulla barra di guida è stata allentata, lo stringere e ricontrollare che il pistone si muove liberamente. </li><li> Spostare lo stantuffo su un lato l&#39;unità montata mescolando al segno zero, laurea microlitri di trasferire la mesofase per l&#39;altra siringa e l&#39;accoppiatore. </li><li> Staccare la siringa vuota (con la sua ghiera in posizione) dal gruppo di miscelazione e immediatamente collegare la siringa carica - con l&#39;accoppiatore unottached - per la cessazione filettato della siringa da 10 microlitri di erogazione. Il grado di tenuta con la quale viene fatto accoppiamento è fondamentale, come già notato. </li><li> Caricare la siringa erogazione premendo lo stantuffo della siringa da 100 microlitri in modo che i trasferimenti mesofase attraverso l&#39;accoppiatore. </li><li> Fissare un breve, a punta piatta ago per la cessazione d&#39;acciaio della siringa di erogazione e con attenzione stringere in posizione. </li><li> Bloccare il pistone al braccio cricchetto serrando il dado sul ring presa. Si deve prestare attenzione a non stringere troppo il dado, in quanto questo può segnare e deformare il pistone rendendolo inutilizzabile. E &#39;importante che la gamma di viaggi forniti al braccio cricchetto nella condizione bloccata essere limitato a non più di un pollice, come dimostrato nel video. Oltre a questo, il pistone avrà una tendenza a fibbia e la consegna può fallire. </li><li> Premere il tamburo cricchetto più volte per far avanzare il pistone nel cilindro, in modo da riempire il volume vuoto l&#39;ago e il caricamento l&#39;ago. Questa operazione deve essere ripetuta (fino a dieci volte) fino a una serie continua di mesofase emerge dalla punta dell&#39;ago. </li><li> Processi di cristallizzazione deve iniziare subito, come alcune proteine ​​sono instabili in fase di cubi senza precipitante aggiunto. </li></ol> Parte 6: Impostazione Piastre cristallizzazione <ol><li> Posizionare un multi-pozzetti cristallizzazione e coprioggetto su un piano rialzato a pochi centimetri sopra il banco di lavoro per la facilità di carico. Contrasto ottimale e una maggiore visibilità si ottengono quando la superficie è leggermente scuro. </li><li> Omogeneizzare la soluzione precipitante e stappare le fiale. Impostare la pipetta precipitante erogazione a 1 microlitri. </li><li> Con la siringa di dosaggio in posizione verticale in una mano, usare la mano libera per posizionare la punta dell&#39;ago al centro e direttamente sopra la base del numero di ben 1. Premere il pulsante sul dispenser ripetizione di espellere un bolo di mesofase sulla superficie del vetro. Il volume del bolo è di 200 nL quando l&#39;erogatore standard di ripetizione viene utilizzato con una siringa da 10 microlitri. La punta dell&#39;ago deve essere non più di qualche centinaio di micrometri di sopra della base del pozzetto per garantire la corretta consegna. </li><li> Dopo 4 pozzi adiacenti sono caricati con mesofase, metti 1 ml di soluzione precipitante in cima ad ogni bolo mesofase con un 2-microlitri pipetta e standard puntali monouso. </li><li> Il più rapidamente possibile, mettere un coprioggetto esattamente sopra i pozzi pieni di coprire in modo uniforme. Per effettuare un sigillo a tenuta d&#39;acqua, utilizzare una spatola per applicare la pressione al coprioggetto dove fa contatto con la superficie esposta appiccicoso del nastro distanziatore. </li><li> Il mesofase e precipitante processo di erogazione può essere ripetuta fino a quando tutti i pozzetti sulla piastra vengono caricati e sigillati. </li><li> Etichetta la piastra in modo chiaro per scopi di monitoraggio. Sensibile alla luce le proteine ​​sono di solito gestiti da avvolgendo le piastre in alluminio prima di metterli nella camera di incubazione. </li><li> Posizionare le piastre in una camera a temperatura controllata, di solito a 20 ° C. </li><li> Su un programma normale, ispezionare i pozzetti per la crescita dei cristalli utilizzando un microscopio a luce polarizzata con un obiettivo di 10 o 20 volte. Il programma utilizzato nel laboratorio dell&#39;autore è la seguente: giorno 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 e 60 di post-installazione. Ispezionare con cura il bolo mesofase regolazione della profondità di campo all&#39;interno del campione 0,14 mm di spessore. L&#39;esame dovrebbe essere fatto sia alla luce normale e tra incrociate polarizzatori. </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante L&#39;aspetto dei cristalli risultante varia con il colore intrinseco della proteina di membrana, la polarizzazione della luce utilizzate per l&#39;ispezione (o mancanza) e il metodo e la qualità dell&#39;illuminazione. La figura 6 mostra diverse apparizioni in cristallo possibile. Proteine ​​di membrana naturalmente colorato crescendo in meso se visti con la luce normale può apparire come quelli mostrati in figura 6 (pannelli b e d). Cristalli incolori proteina di membrana in crescita nella fase cubi se visti con la luce normale può apparire come quelli mostrati in figura 6 (Pannello di e). Infine, cristalli incolori proteina di membrana crescendo in meso se vista con luce polarizzata può apparire come figura 6 (pannelli A e C). Le prossime fasi del processo generale di determinazione della struttura sono a raccolta e crio-raffreddare i cristalli e di registrare ed analizzare diffrazione ai raggi X da loro. Questi argomenti sono a carico JOVE in articoli separati. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di una membrana biologica che mostra il doppio strato lipidico e sulla quale si trovano una varietà di proteine. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La strutturadella vitamina B 12 trasportare proteine, BtuB, risolto con MX e cristalli cresciuti dal metodo in meso 6 illustrato in questo articolo Giove. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La struttura-funzione del ciclo illustra molti dei passi necessari per ottenere e utilizzare informazioni complete su una proteina strutturale. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Il diagramma riassume le fasi coinvolte nella produzione di cristalli di proteina di membrana dal meso nel metodo. Solo quei passi circondato dalla linea tratteggiata rossa sono trattati in questo articolo Giove. Dal riferimento 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Semplificata temperatura-composizione per il diagramma di fase lipidica (monoolein) / sistema idrico. Processi di cristallizzazione sono impostati a 20 ° C dove la lipidico satura con acqua a 40% l&#39;idratazione. Il diagramma di fase dettagliato è disponibile nella Guida di riferimento 5. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Cristalli di proteine ​​di membrana crescita nel mesofase lipidico. (A), vitamina B 12 proteine ​​di trasporto, BtuB 6, (b) che raccolgono la luce complesso II 7, (c) la adesina / invasin OPCA 8, (d) batteriorodopsina 9, (e) un trasportatore di carboidrati da Pseudomonas. Le immagini registrate con la luce normale (b, d, e) e tra polarizzatori incrociati (a, c).

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	<li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter,+BtuB,+at+1.95+A+resolution.">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li><li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room+to+move:+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases.">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin.">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li><li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases.">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li></ol>

La fase di cubo è un ambiente delicato e dinamico che può cambiare drasticamente con l&#39;alterazione di una serie di variabili. Non è possibile dare una descrizione del setup di cristallizzazione negli studi meso in modalità manuale che descrive tutti i potenziali insidie. Tuttavia, molte difficoltà possono essere evitate praticando la tecnica prima di applicarlo a costose soluzioni di proteine ​​e usando moderazione della pressione applicata al siringhe durante la miscelazione. Fatto correttamente, il metodo in meso può produrre cristalli di una grande varietà di proteine, il cui numero è in costante aumento. La descrizione data qui della configurazione nei processi di cristallizzazione meso è incentrata sulla modalità manuale. Il processo può essere, e spesso viene modificato per facilitare l&#39;installazione automatica delle piastre di cristallizzazione in quei casi che richiedono uno screening su larga scala delle condizioni di cristallizzazione.

* Dettagli completi per la lavorazione del tuo accoppiatore stretta Alesaggio sono forniti in riferimento 3.

crystallizing membrane proteins for structure determination using lipidic mesophases

Un protocollo dettagliato per cristallizzare proteine ​​di membrana utilizzando mesophases lipidico è descritto. Questo metodo è stato variamente definito la fase lipidica cubi o nel metodo meso. Il metodo ha dimostrato di essere molto versatile in quanto è stato utilizzato per risolvere i raggi X delle strutture cristallografiche di proteine ​​procarioti ed eucarioti, proteine ​​che sono monomeriche, omo-ed etero-multimerica, cromoforo contenenti e cromoforo-free, e alfa elica e beta-barile proteine. Recenti successi utilizzando in cristallizzazione meso sono progettati umano beta2-adrenergici e adenosina A2a G recettori accoppiati alla proteina. I protocolli sono presentati per la ricostituzione della proteina di membrana in monoolein basato mesofase, e per la creazione di cristallizzazioni in modalità manuale. Ulteriori passi nel processo globale, come la raccolta di cristallo, sono da affrontare in articoli futuro video. Il tempo necessario per preparare la proteina-caricato mesofase e di istituire un piatto cristallizzazione manualmente è di circa un&#39;ora.

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Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

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Research

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29.8K Views.  Trinity College Dublin. Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

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Biologia

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Cella di rilevamento utilizzando proteine ​​Photoconvertible durante lo sviluppo Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Cristallizzare proteine di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica