Le infezioni virali sono altamente dinamiche e i test degli endpoint tradizionali in virologia hanno una limitazione che un endpoint scelto può portare a informazioni perse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che con l'impedenza elettrica basata su cellule, è possibile seguire un'infezione virale e l'attività dei composti antivirali in tempo reale. A dimostrare questa procedura sarà Eef Meyen, un tecnico di laboratorio del nostro laboratorio.
Per iniziare, preparare la piastra CEI prendendo una piastra interdigitata a 96 pozzetti basata su elettrodi. Aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura di crescita a ciascun pozzetto e riempire gli spazi tra i pozzetti con DPBS. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore.
Per seminare le cellule A549, staccarle dal pallone di coltura come descritto nel manoscritto e risospenderle in un nuovo terreno di crescita. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri. Contare le cellule vitali e diluirle in terreno di crescita fresco per ottenere la densità cellulare desiderata.
Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura di crescita con una pipetta multicanale dalla piastra a 96 pozzetti. Erogare 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto. Una volta che le celle sono equilibrate, posizionare la piastra nel dispositivo CEI per impostare ed eseguire il test CEI.
Apri il software del dispositivo e nel riquadro Raccogli dati fai clic su Configurazione per impostare un nuovo esperimento. Collegare un computer portatile al dispositivo ECIS. Configurare la piastra controllando le impedenze dei pozzetti come indicato da un colore verde.
Nel riquadro Configurazione pozzo, selezionare il tipo di array in base al cultureware utilizzato e fare clic su Modalità tempo a frequenza multipla. Quindi, avviare la misurazione premendo Start. Mantenere il composto sul ghiaccio.
Effettuare la diluizione 10 volte concentrata con un mezzo di dosaggio equilibrato in un tubo di polipropilene da cinque millilitri e quindi aggiungere il composto. Nel riquadro Configurazione raccolta dati fare clic su Pausa e, dopo aver completato l'intervallo di tempo corrente, estrarre la piastra a 96 pozzetti. Osservare l'aderenza e la formazione monostrato delle cellule al microscopio ottico.
Quindi, aspirare 20 microlitri di mezzo da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e aggiungere 20 microlitri di soluzione composta o veicolo nei pozzetti desiderati. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 15 minuti. Per preparare la soluzione virale, scongelare una fiala di stock di virus.
Dopo aver effettuato le diluizioni al MOI desiderato con mezzo di dosaggio in un tubo di polipropilene da 15 millilitri, aggiungere il materiale virale. Una volta aggiunta la diluizione del virus nei pozzetti assegnati, aggiungere 100 microlitri di terreno di analisi ai pozzetti di controllo cellulare. Quindi, decontaminare i contenitori di virus impiegati.
Riposizionare la targa nel dispositivo CEI e cliccare su Riprendi per continuare le misurazioni per sei giorni consecutivi. Per analizzare i dati, fai clic su Fine per terminare l'esperimento e aggiungere Inserisci riepilogo esperimento. Una volta completata la raccolta dei dati, selezionare OK. Selezionare la frequenza desiderata nel riquadro Grafico.
Assicurarsi che tutti i pozzi siano selezionati nel riquadro Configurazione pozzo e fare clic su File, quindi su Esporta dati, quindi su Dati grafico per esportare i dati in formato foglio di calcolo. Il test CEI ha mostrato che la cinetica dell'infezione era altamente dipendente dal tipo di cellula e le cellule U87 erano suscettibili all'infezione da virus Zika solo con MOI elevati. I test CEI hanno anche dimostrato un monostrato cellulare completamente cresciuto ad alta semina cellulare e non può diffondersi ulteriormente attraverso gli elettrodi CEI, portando a una leggera differenza tra il controllo cellulare e il controllo del virus.
Per U87, un tipo di cellula più grande, seminare cellule troppo densamente potrebbe aver portato al completo distacco del monostrato cellulare. Un ceppo rappresentativo del virus Zika dell'africano MR766 nella linea asiatica PRVABC59 ha mostrato modelli CEI simili. Tuttavia, PRVABC59 ha proprietà di induzione di effetti citopatici leggermente più lente, riflesse anche dai valori di CIT50.
I profili di impedenza di tre diversi MOI di entrambi i ceppi del virus Zika hanno dimostrato che la particolare concentrazione del composto ritarda la caduta di impedenza causata dall'infezione da virus Zika. Il test CEI ha rivelato che l'attività antivirale dipendeva dai calcoli MOI e AUCN determinati dai valori IC50. I valori CIT50 valutati hanno dimostrato potenze composte nella cinetica della crescita cellulare e dell'infezione.
CEI è una potente tecnologia per valutare e caratterizzare composti contro la replicazione del virus Zika in tempo reale, label-free, e non invasivo.
