Questo metodo può essere utilizzato per valutare gli effetti dell'immunità preesistenti contro il virus dengue sull'infezione da virus Zika, utilizzando il siero del paziente umano reale e le cellule immunitarie umane primarie. L'uso di campioni reali di siero del paziente umano e cellule primarie umane fornisce una visione più approfondita del potenziamento dipendente dagli anticorpi del virus Zika da parte di sieri e anticorpi pre-immuni. Questo metodo fornisce informazioni sulla capacità degli anticorpi all'interno del sangue di un paziente di migliorare un'infezione da virus in altre cellule umane.
È importante assicurarsi che i livelli di infezione virale siano abbastanza alti per il rilevamento ma abbastanza bassi da non sopraffare le cellule o interferire con l'interpretazione dei dati. Inizia seminando tre volte dieci fino alle quattro cellule in 100 microlitri di terreno di coltura cellulare per pozzo in una piastra sterile a fondo piatto da 96 porri. Una volta che tutte le cellule sono state placcate, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% e effettuare diluizioni seriali di 10 volte di campioni di siero umano scongelati in mezzo privo di siero.
Assicurarsi di mantenere costanti le diluizioni del siero e il fattore di diluizione per tutti i sieri pre-immuni prima di aggiungere le diluizioni alle soluzioni virali e alle cellule. Successivamente, scongelare la soluzione stock di ceppi del virus Zika in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per uno o due minuti prima di trasferire rapidamente lo stock sul ghiaccio. Aggiungere una molteplicità 0.1 di volume equivalente di infezione del virus Zika alle aliquote siere e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora per consentire agli anticorpi del virus dengue di formare complessi con i virioni Zika.
Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule con 100 microlitri di PBS per pozzo e aggiungere 50 microlitri di complesso immunitario ad ogni pozzo. Dopo l'incubazione di due ore, rimuovere il mezzo e lavare i pozzi due volte con 100 microlitri di PBS per pozzo per rimuovere completamente i complessi immunitari e eventuali virioni non attaccati. Quindi nutrire le cellule con 100 microlitri per pozzo di mezzo di coltura cellulare integrato con siero bovino fetale al 10%.
Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per 48 ore. Due giorni dopo l'infezione, lavare le cellule due volte con 100 microlitri di PBS sterile per pozzo prima di aggiungere 250 microlitri di tampone di lysis cellulare con mercaptoetanolo 10%beta ad ogni pozzo. Pipetta su e giù almeno cinque volte con graffi per accelerare il processo di lisi e trasferire i litolati cellulari in tubi sterili etichettati da 1,5 millilitri.
Aggiungere un volume uguale di 70%etanolo a ciascun tubo e pipettare la soluzione di lysate su e giù da quattro a cinque volte. Quando le sospensioni del lisato sono chiare, trasferire ogni soluzione in colonne etichettate a base di silice in due tubi di raccolta millilitro per la centrifugazione. Scartare il flusso mantenendo le colonne negli stessi tubi di raccolta e aggiungere 700 microlitri di Wash Buffer 1 a ciascuna colonna per una seconda centrifugazione.
Dopo aver scartato il flusso, sciacquare le colonne altre due volte con 500 microlitri di Wash Buffer due per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, trasferire le colonne in nuovi tubi di raccolta a due millilitri per un'altra centrifugazione. Aggiungere 30 microlitri di acqua priva di RNasi di 42 gradi Celsius al centro di ogni colonna per la centrifugazione e recuperare l'RNA eluito.
Per la reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale o l'analisi QRTPCR aggiungere un microlitro di primer gene specifici avanti e indietro da 10 scorte micromolari insieme a 0,25 microlitri di mix di trascrittasi inversa per reazione. Si noti che i primer che riconoscono il materiale genetico del virus Zika rileveranno i geni virali e consentiranno la quantificazione delle infezioni. Successivamente, aggiungere 12,5 microlitri di SYBR Green Mix seguiti da 25 microlitri di acqua ad ogni reazione aggiungendo 15 microlitri di Master Mix in ogni pozzo di piastra QPCR da 96 po '.
Quando si utilizza un Master Mix, aggiungere 100 nanogrammi del campione di RNA alla miscela e pipettare il Master Mix in singoli pozzi della piastra QRTPCR. Si noti che i campioni devono essere eseguiti in triplice copia sulla stessa piastra QRTPCR. Quindi eseguire i campioni su una macchina PCR quantitativa in base ai parametri delineati nella tabella.
Facendo clic sulla linguetta della curva di fusione nel software di sistema per monitorare la curva di fusione. La curva di fusione mostrerà un singolo picco in tutti i campioni per un particolare gene per confermare la presenza di un solo amplicon. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare incrementi di temperatura di 0,5 gradi Celsius tra i passaggi e un tempo di attesa minimo di 10 secondi nel protocollo della curva di fusione.
Quindi fare clic sulla scheda dati di quantificazione per ottenere un ciclo quantitativo per ogni campione ed esportare i dati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi di quantificazione. I campioni di siero umano possono essere classificati in tre diversi gruppi: campioni confermati di infezione da virus dengue, campioni confermati di anticorpi del virus dengue e sieri sani senza anticorpi neutralizzanti del virus dengue o RNA. Dopo 48 ore di infezione, l'analisi QRTPCR dimostra che la maggior parte dei sieri contenenti sierotipo del virus dengue da uno a quattro anticorpi sono in grado di migliorare la replicazione del virus Zika a diversi livelli.
L'aumento più elevato dei titoli del virus Zika si riscontra nei macrofagi trattati con sierotipo due e quattro anticorpi del virus dengue contenente sieri rispetto al sierotipo uno e tre che mostrano un'induzione relativamente inferiore del virus Zika. È importante mantenere un ambiente sterile, indossare le corrette apparecchiature di protezione individuale e mantenere sempre i campioni di siero del virus scongelati e i reagenti QPCR sul ghiaccio. Questo protocollo può essere facilmente modificato per studiare il miglioramento dipendente dagli anticorpi di altri flavivirus come virus della febbre gialla, virus dengue o virus del Nilo occidentale utilizzando un pannello di siero del paziente.
Questa tecnica sarà molto utile per eseguire futuri studi di potenziamento dipendenti dagli anticorpi nei campi dell'arbovirus o della virologia. Un adeguato livello di biosicurezza due dispositivi di protezione individuale dovrebbero essere utilizzati in ogni momento e tutti i rifiuti virali devono essere decontaminati in candeggina al 10% per 30 minuti prima dello smaltimento.
