Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie infettive. Per quanto riguarda la febbre dengue, o febbre di Chikungunya. Il principale vantaggio di questa tecnica stessa, è in grado di quantificare l'RNA virale in modo semplice e rapido.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su una ricerca di base sui virus, può anche essere applicato ad altre ricerche come lo studio di screening dei farmaci ad alto contenuto e la diagnosi clinica contro i virus populogenici umani. La dimostrazione principale di questo metodo è fondamentale. Poiché i timbri per la lavorazione del campione e un armadio per la biosicurezza sono importanti per evitare contaminazioni incrociate o infezioni di laboratorio.
A dimostrare la procedura saranno un assistente professore e il nostro assistente tecnico del nostro laboratorio. Dopo aver preparato il modello di DNA per lo standard RNA, mescolare la reazione di trascrizione in vivo con 100 nanogrammi del modello di DNA preparato in un tubo PCR da 0,2 millilitri. Incubare a 37 gradi Celsius in un termociclometro per due ore.
Dopo questo, aggiungere un microlitro di DNAase e continuare l'incubazione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Impostare un kit di purificazione dell'RNA e aggiungere 80 microlitri di acqua libera RNAase e 350 microlitri di tampone di cattura, tra cui l'1%betamarcaptoetanolo alla miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitro. Aggiungere 250 microlitri di etanolo al 100% e utilizzare una pipetta per mescolare.
Quindi, assemblare una colonna di purificazione dell'RNA con un tubo di raccolta. Trasferire il campione di RNA nella colonna di purificazione. Centrifugare la colonna a 8.000 volte G per 15 secondi e scartare il flusso.
Quindi, applicare 500 microlitri di tampone di lavaggio sulla colonna e centrifugare a 8.000 volte G per due minuti. Successivamente, posizionare la colonna in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 50 microlitri di acqua priva di RNAase e incubare a temperatura ambiente per un minuto.
Centrifugare la colonna alla massima velocità per un minuto per allutare l'RNA. Usando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica di 3 microlitri dell'RNA alluted a 260 nanometri. Quindi, determinare il numero di copia del virus Dengue sintetizzato tre RNA UTR primi.
Conservare lo standard dell'RNA a meno 80 gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'uso. In primo luogo, mescolare 199 microlitri di tampone di lavorazione con un microlitro di proteinasi K. senza nucleasi Utilizzando il mezzo di coltura cellulare, diluire serialmente il virus Dengue preparato tre RNA UTR primo uno a dieci per ottenere standard di RNA a concentrazioni che vanno da 5.000.000 a 5.000 copie per microlitro ripetendo pipettazione e vortice. Trasferire 5 microlitri del supernatante di coltura delle cellule infette dal virus Dengue e dello standard di RNA UTR primario dengue virus 3 su strisce PCR A2 o sui pozzi di una piastra PCR da 96 po '.
Mescolare in cinque microlitri della soluzione contenente tampone di lavorazione e proteinasi K.Centrifugare brevemente a 200 volte G per cinque secondi. Incubare i campioni in un termociclometro a 25 gradi Celsius per dieci minuti e poi a 75 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando il virus Dengue tre prime prime prime utr e una sonda fluorogenica, preparare un mix master PCR RTQ con un reagente PCR RT a un passo in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri.
Alloquote otto microlitri del master si mescolano in un pozzo di una piastra PCR in tempo reale da 96. Quindi, aggiungere due microlitri di ogni campione a ciascun pozzo della piastra PCR ben in tempo reale 96. Sigillare la piastra con pellicola adesiva otticamente chiara.
Centrifugare brevemente le piastre a 200 volte G per cinque secondi per rimuovere eventuali bolle d'aria. Quindi, posizionare la piastra in uno strumento PCR in tempo reale. Utilizzando un software associato pcr in tempo reale, passare alla finestra di configurazione e assegnare il pozzo di una reazione da analizzare come campione sconosciuto.
Successivamente, assegnare il pozzo del virus Dengue diluito in serie tre RNA UTR primi come standard e digitare il numero di copia previsto dello standard RNA in ogni pozzo. Assegnare il controllo non modello come controllo negativo. Quindi, avviare lo strumento RT PCR e ciclo la piastra come delineato nel protocollo di testo.
Nella finestra di analisi fare clic su analizza e assicurarsi che il coefficiente di correlazione della curva standard generata sia equivalente o maggiore di 0,98. In genere, utilizzare le impostazioni CT predefinite per l'analisi. In questo studio, una diluizione seriale di dieci volte dell'RNA standard del virus Dengue è sottoposta ad un'analisi PCR RTQ diretta utilizzando tre prime prime UTR specifiche prime e una sonda fluorgenica.
La curva lineare di questa analisi mostra che la correlazione è buona. Successivamente, questo saggio DIRETTO DI PCR RTQ viene applicato per quantificare il virus Dengue nel supernatante di coltura delle cellule infettate da virus. Una buona correlazione è osservata tra il titer dell'infezione da virus Dengue e la TC, un numero di ciclo che è considerato il punto in cui il segnale fluorescente aumenta con una crescita esponenziale sopra lo sfondo.
Quando i valori TC generati da una diluizione seriale dello stock di virus Dengue con titolo infettivo noto vengono tracciati sulla curva standard generata in precedenza, i dati per i campioni compresi tra 08 e 8.000 PFU per reazione sono considerati nell'intervallo di quelli sottoposti a RNA standard. Ciò indica che i campioni di virus Dengue con una vasta gamma di titolo infettivi possono essere analizzati contemporaneamente quando si utilizza questa tecnica. Questo saggio viene ulteriormente valutato per la sua applicabilità alla convalida degli agenti antivirali contro il virus Dengue.
Se trattato con 50 microgrammi per millilitro di MPA, si osserva una riduzione di circa il 99,87% della coltura di controllo trattata con DMSO. Infine, vengono testate le applicazioni di questo saggio con altri virus dell'RNA. Quando uno stock di ceppo vaccino 17D Yellow Fever Virus viene sottoposto a RTQ PCR diretto, viene generata una curva standard con una buona correlazione diretta tra i titoli dei virus e i valori TC.
Allo stesso modo, l'analisi DIRETTA DELLA PCR RTQ del virus del morbillo e dello stock di ceppo grezzo del virus chikungunya fornisce una buona regressione tra titolo infettivo e valori TC. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo dello studio di screening. Consentire a un gran numero di campioni di esplorare nuovi farmaci antivirali equivale a semplicistico.
Non dimenticare che lavorare con materiali re-infettivi può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale e un armadio per la biosicurezza pulita dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
