Vorremmo ringraziare David Rodriguez per l'assistenza con la preparazione della figura e Precision Pathology Services (San Antonio, TX) per l'uso del suo citometro a flusso Navios EX.

Tutte le procedure devono essere eseguite utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati.
1. Preparazione della soluzione madre TCPP, 1,0 mg / ml
NOTA: Questo può essere preparato mensilmente.
<ol><li>Utilizzando una bilancia analitica, una spatola e una carta da pesata, pesare 49,0-50,9 mg di TCPP. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo. Mettere da parte la quantità misurata di TCPP al riparo dalla luce. NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile.</li>
	<li>Determinare le quantità richieste di acqua purificata e isopropanolo (IPA) dalla Tabella 1 in base alla quantità di TCPP pesata nel passaggio 1.1 . Aggiungere l'acqua purificata e l'isopropanolo in un becher di vetro da 100 ml e coprire con parafilm per proteggere dall'evaporazione.</li>
	<li>Determinare la quantità richiesta di bicarbonato di sodio dalla Tabella 1 in base alla quantità di TCPP pesata nel passaggio 1.1 .</li>
	<li>Utilizzando la bilancia analitica, la spatola e la carta da lavoro, pesare la quantità necessaria di bicarbonato di sodio determinata al punto 1.3. Arrotondare il peso a 1/10 di milligrammo. NOTA: Utilizzare una pistola statica se la lettura del peso è instabile.</li>
	<li>Aggiungere il bicarbonato di sodio al becher da 100 mL contenente acqua purificata e isopropanolo. Coprire la soluzione con parafilm per proteggere dall'evaporazione.</li>
	<li>Porre la soluzione dal punto 1.5 su una piastra di agitazione e mescolare fino a quando non si scioglie (circa 10 min)</li>
	<li>Misurare il pH per assicurarsi che la soluzione contenente bicarbonato di sodio del punto 1.6 abbia un pH compreso tra 9 e 10.</li>
	<li>Aggiungere lentamente il TCPP pesato al punto 1.1 alla soluzione dal punto 1.7 e continuare a mescolare fino a quando non si è sciolto (~30 min). Proteggere dalla luce durante questa fase.</li>
	<li>Conservare in un contenitore di vetro o polipropilene a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.</li>
</ol>2. Preparazione di acido 2-(N-morfolino)-etanosolfonico (MES) e soluzione tampone di sali semisodici, 0,1 M, pH 6,0-6,2 ("tampone MES")
NOTA: Questo deve essere preparato il giorno dell'uso e conservato a temperatura ambiente.
<ol><li>Pesare 2,50 g di sale semisodico MES e aggiungerlo a un flacone di plastica da 150 ml.</li>
	<li>Aggiungere 121 ml di acqua purificata e sciogliere agitando manualmente fino a quando non è visibile alcun solido.</li>
	<li>Misurare il pH del tampone MES per assicurarsi che sia compreso tra 6 e 6,2.</li>
	<li>Mantenere a temperatura ambiente per l'uso nello stesso giorno.</li>
</ol>3. N-(3-Dimethlyaminopropyl)-N'-etilcarbodiimmide (EDC) polvere
<ol><li>Estrarre la polvere EDC dal congelatore e lasciarla riposare a temperatura ambiente fino all'uso nella fase 5.</li>
</ol>4. Combinazione di perle di polistirene funzionalizzate con ammina con soluzione TCPP
<ol><li>Aggiungere 4,3 mL della soluzione tampone MES da 0,1 M preparata nella fase 2 in un tubo di polipropilene da 15 ml.</li>
	<li>Vortex la sospensione di perline di polistirene funzionalizzata all'ammina (10 μm, 2,5% p/v) per 60 s alla massima velocità.</li>
	<li>Aggiungere 288 μL di questa sospensione di perline appena vortexed al tampone MES dal punto 4.1.</li>
	<li>Vortex la soluzione MES/bead per 15 s alla massima velocità.</li>
	<li>Vortex la soluzione TCPP da 1 mg/mL preparata al punto 1 per 60 s alla massima velocità.</li>
	<li>Aggiungere 1,20 mL di questa soluzione madre TCPP appena vortexed alla sospensione MES/bead dal punto 4.4.</li>
	<li>Vortex la sospensione MES/bead/TCPP per 15 s alla massima velocità.</li>
	<li>Coprire il tubo con un foglio mentre la soluzione EDC è preparata.</li>
</ol>5. Preparazione della soluzione madre di idrocoloride (HCl) di N-(3-dimetlyaminopropil)-N'-etilcarbodiimmide (EDC)
NOTA: La soluzione EDC è deperibile e deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione.
<ol><li>Aggiungere 20,0 ml di acqua purificata in un nuovo tubo conico da 50 ml.</li>
	<li>Pesare 200 mg di EDC HCl dal punto 3 e aggiungerlo all'acqua (punto 5.1).</li>
	<li>Vortice l'EDC HCL per 15 s alla massima velocità per generare una soluzione chiara.</li>
</ol>6. Preparazione della soluzione di lavoro EDC HCl/MES
NOTA: La soluzione EDC HCl/MES è deperibile e deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione.
<ol><li>Aggiungere 54,0 mL di soluzione tampone MES (preparata al punto 2) in un flacone di plastica da 150 ml.</li>
	<li>Aggiungere 6,0 mL della soluzione madre EDC HCl (preparata al punto 5) alla soluzione tampone MES e mescolare agitando per 10 s.</li>
</ol>7. Etichettatura delle perline con TCPP
<ol><li>Aggiungere 4,5 mL di soluzione di lavoro EDC (dal punto 6) al tubo di polipropilene da 15 mL contenente le perline e TCPP nel tampone MES (punto 4.7).</li>
	<li>Posizionare il tubo in un rotatore invertente a 35 giri / min per 16 ore a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a temperatura ambiente per 10 minuti a 1.000 × g.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e risospendere le perle in 0,8 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS).</li>
	<li>Trasferire la soluzione di perline in un flaconcino di polipropilene ambrato con una pipetta da 1 mL e conservare a 4 °C fino a ulteriore utilizzo. NOTA: Le perle sono stabili per almeno 3 mesi a questo punto.</li>
</ol>8. Controllo di qualità (QC) delle sfere TCPP mediante citometria a flusso
NOTA: il QC deve essere centrato sul fatto che l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) delle sfere TCPP sia sufficientemente luminosa per l'uso previsto e la quantità di particolato generato dalla procedura. Per ulteriori dettagli, consulta la sezione dei risultati rappresentativi.
<ol><li>Etichettare un tubo di polistirene da 5 ml come "perline negative TCPP". NOTA: Le perle negative sono diverse dalle perle funzionalizzate dall'ammina utilizzate per l'etichettatura. Vedere la tabella dei materiali.</li>
	<li>Etichetta un altro tubo come "perline positive TCPP".</li>
	<li>Etichetta un altro tubo come "Perline arcobaleno".</li>
	<li>Aliquot 300 μL di HBSS ghiacciato nei tubi etichettati con "perline negative TCPP" e "perline positive TCPP".</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di HBSS ghiacciato nel tubo etichettato come "perline arcobaleno".</li>
	<li>Vortice la sospensione del cordone in polistirene non funzionalizzato (non etichettato) brevemente alla massima velocità (2-3 s) e aggiungerne 10 μL al tubo etichettato "perline negative TCPP".</li>
	<li>Vortice la sospensione del tallone marcata TCPP (finalizzata al punto 7.5) brevemente alla massima velocità e aggiungerne 3 μL al tubo "perline positive TCPP".</li>
	<li>Vortice la sospensione del tallone arcobaleno brevemente alla massima velocità e aggiungine due gocce nel tubo "Perline arcobaleno".</li>
	<li>Tenere tutti i tubi sul ghiaccio, coperti e protetti dalla luce.</li>
	<li>Avviare le procedure di avvio giornaliere appropriate del citometro a flusso ed eseguire un controllo qualità per verificare i fluidi ottimali e l'allineamento laser. NOTA: Per questa parte del protocollo, si presume che l'operatore sia addestrato nell'uso del citometro a flusso disponibile, comprese le procedure di standardizzazione della diffusione della luce e dell'intensità della fluorescenza, nonché i principi di base del calcolo della corretta matrice di compensazione.</li>
	<li>Eseguire le perline arcobaleno e le perline TCPP senza modificare le impostazioni di tensione tra le diverse esecuzioni.<ol><li>Corri e raccogli 10.000 eventi delle perline arcobaleno.</li>
		<li>Eseguire un risciacquo con acqua e raccogliere 10.000 eventi delle perle TCPP-negative.</li>
		<li>Eseguire un risciacquo con acqua e raccogliere 10.000 eventi delle perline TCPP-positive.</li>
		<li>Eseguire un risciacquo con acqua di 1 minuto. NOTA: è importante eseguire un risciacquo con acqua dopo aver eseguito le perline TCPP. Se il TCPP non viene risciacquato dalle linee nel citometro, esiste la possibilità che il TCPP residuo possa etichettare le cellule nella provetta successiva da acquisire.</li>
		<li>Eseguire i protocolli di pulizia e spegnimento appropriati specifici per le istruzioni del produttore per il citometro. NOTA: per i risultati rappresentativi, vedere la Figura 1.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Filtrazione delle perle
NOTA: Se il controllo qualità delle sfere mediante citometria a flusso (fase 8) mostra un'alta percentuale di particolato (70% o superiore), considerare il filtraggio della sospensione del tallone utilizzando il protocollo riportato di seguito (Figura 2).
<ol><li>Aggiungere 3,20 ml di HBSS ghiacciato a 0,8 ml della sospensione a cordone TCPP finalizzata al passaggio 7.5 (creazione di una diluizione di cinque volte).</li>
	<li>Vortex la sospensione del tallone diluito alla massima velocità per 15 s.</li>
	<li>Rimuovere lo stantuffo da una siringa monouso da 5 ml.</li>
	<li>Montare la siringa con un filtro a punta in fibra di vetro (5 μm, diametro 13 mm).</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di HBSS alla siringa.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL della sospensione a sfere diluite a vortice (punto 9.2).</li>
	<li>Utilizzare lo stantuffo per filtrare la sospensione attraverso la configurazione della siringa/filtro a circa 2 gocce/s.</li>
	<li>Lavare le perle aspirando 5 mL di HBSS fresco nella siringa attraverso il filtro a circa 2 gocce/s.</li>
	<li>Spingere nuovamente l'HBSS nel contenitore dei rifiuti a circa 2 gocce/s.</li>
	<li>Per rimuovere le sfere dal filtro, aspirare altri 5 ml di HBSS fresco nella siringa attraverso il filtro.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il filtro dalla siringa.</li>
	<li>Espellere la sospensione del tallone dalla siringa in una provetta conica da centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Riposizionare il filtro sulla siringa e ripetere i passaggi 9.10-9.12 altre quattro volte. Quindi gettare il filtro e la siringa.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 9.2-9.13 fino a filtrare tutte le perline del passaggio 9.1. Utilizzare una siringa nuova e filtrare ogni volta.</li>
	<li>Centrifugare le sospensioni di sfere filtrate per 10 minuti a 1.000 × g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il surnatante di ogni tubo da 50 mL e risospendere delicatamente le perle, combinandole in 0,5 mL di HBSS fresco.</li>
	<li>Trasferire le perle con una micropipetta p1.000 in un nuovo flaconcino di ambra, vetro o polipropilene e conservare a 4 °C.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 8 per determinare se la percentuale di particolato correlato al TCPP nella sospensione del tallone filtrato è diminuita. Per i risultati rappresentativi, vedere la Figura 3.</li>
</ol>

Perle modificate con porfirina in citometria a flusso

<ol>
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US7670799B2 - Method for making 5,10,15,10-tetrakis (carboxyphenyl) porphine (TCPP) solutions and composition compromising TCPP Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en">https://patents.google.com/patent/US7670799B2/en</a> (2023)</li><li>Shimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+affinity+beads+for+identifying+drug+receptors.">High-performance affinity beads for identifying drug receptors.</a> Nature Biotechnology. 18 (8), 877-881 (2000).</li><li>Anderson, G. W., Zimmerman, J. E., Callahan, F. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry Part B. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Hoffman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization,+calibration,+and+control+in+flow+cytometry.">Standardization, calibration, and control in flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2005).</li><li>Ethirajan, M., Chen, Y., Joshi, P., Pandey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+porphyrin+chemistry+in+tumor+imaging+and+photodynamic+therapy.">The role of porphyrin chemistry in tumor imaging and photodynamic therapy.</a> Chemical Society Reviews. 40 (1), 340-362 (2011).</li><li>Beharry, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+photodynamic+therapy:+New+probes+for+cancer+imaging+and+treatment.">Next-generation photodynamic therapy: New probes for cancer imaging and treatment.</a> Biochemistry. 57 (2), 173-174 (2018).</li><li>El-Far, M., Pimstone, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+28+porphyrins+and+their+abilities+to+localize+in+mammary+mouse+carcinoma:+Uroporphyrin+I+superior+to+hematoporphyrin+derivative.">A comparative study of 28 porphyrins and their abilities to localize in mammary mouse carcinoma: Uroporphyrin I superior to hematoporphyrin derivative.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 170, 661-672 (1984).</li></ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di bioAffinity Technologies.

Nonostante le numerose applicazioni delle porfirine nella diagnosi e nella terapia del cancro2, esiste una letteratura limitata sul loro potenziale uso come reagente citometrico a flusso per l'identificazione di popolazioni cellulari cancerose e non cancerose nei tessuti umani primari24,25,26. La nostra ricerca sull'analisi citometrica a flusso dell'espettorato umano24,27</sup...

Le porfirine sono di interesse da molti anni in campo biomedico grazie alla loro fluorescenza e alle proprietà tumorali 1,2,3. Le applicazioni terapeutiche come la terapia fotodinamica (PDT) e la terapia sonodinamica (SDT) comportano la somministrazione sistemica di una porfirina a un paziente oncologico, l'accumulo del farmaco nel tumore e l'esposizione localizzata del tumore a una luce laser di una specifica lunghezza d'onda o ultrasuoni. L'esposizione alla luce laser o agli ultrasuoni porta alla generazione di specie reattive dell'ossigeno da parte della porfirina e alla successiva morte cellulare 4,5. Nella diagnosi fotodinamica (PDD), la fluorescenza della porfirina viene utilizzata per distinguere le cellule tumorali dalle cellule normali6. In questo contesto, la protoporfirina IX, una porfirina fluorescente naturale che si accumula nei tumori dopo l'iniezione sistemica o locale del suo precursore, l'acido 5-aminolevulinico (5-ALA), viene utilizzata per identificare i tumori stromali gastrointestinali, il cancro della vescica e il cancro al cervello 7,8. Più recentemente, il trattamento con 5-ALA è stato esplorato come approccio per rilevare la malattia residua minima nel mieloma multiplo9. Il nostro laboratorio ha utilizzato la porfirina tetraarilica TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carbossifenil)-21,23 H-porfina) per la sua capacità di colorare selettivamente le cellule tumorali polmonari e le cellule associate al cancro in campioni di espettorato umano, che è una proprietà che è stata sfruttata in saggi diagnostici citometrici basati su vetrini e a flusso10.
Alcune porfirine sono bifunzionali in quanto possono essere utilizzate come agenti terapeutici e diagnostici 2,11. Nella ricerca biomedica, tali porfirine bifunzionali sono utilizzate per valutare come la loro capacità di colpire selettivamente e uccidere le cellule tumorali sia una funzione della loro struttura e come sia influenzata dalla presenza di altri composti 12,13,14,15,16. Sia l'assorbimento cellulare delle porfirine che la loro citotossicità possono essere misurati su una piattaforma citometrica a flusso in modo ad alto rendimento. Gli spettri di assorbimento ed emissione delle porfirine fluorescenti sono complessi, ma la maggior parte delle piattaforme citometriche a flusso sono attrezzate per identificarle correttamente. Lo spettro di assorbimento delle porfirine fluorescenti è caratterizzato da una forte banda di assorbimento nell'intervallo 380-500 nm, nota come banda Soret. Da due a quattro bande di assorbimento più deboli sono generalmente osservate nell'intervallo 500-750 nm (bande Q)17. Un laser blu da 488 nm, presente nella maggior parte dei citometri a flusso, o un laser viola (405 nm) possono generare luce della lunghezza d'onda appropriata per eccitare le porfirine. Gli spettri di emissione delle porfirine mostrano tipicamente picchi nell'intervallo 600-800 nm18, il che si traduce in una sovrapposizione spettrale molto piccola con i fluorofori di isotiocianato di fluoresceina o ficoeritrina (PE), ma una notevole sovrapposizione con altri fluorofori spesso usati, come l'alloficocianina (APC), così come i fluorofori tandem, come PE-Cy5 e altri. Pertanto, quando si utilizzano le porfirine in saggi di citometria a flusso multicolore, i controlli a singolo fluoroforo sono essenziali per correggere adeguatamente lo spillover della fluorescenza in canali diversi da quello designato per misurare la fluorescenza della porfirina.
Idealmente, i controlli a singolo fluoroforo utilizzati per calcolare la matrice di spillover per un pannello di fluorofori (chiamati anche "controlli di compensazione") dovrebbero essere costituiti dallo stesso tipo di cella del campione. Tuttavia, l'utilizzo del campione per questo scopo non è ottimale se c'è pochissimo campione per iniziare o se la popolazione target all'interno del campione è molto piccola (ad esempio, se si vuole guardare alla malattia residua minima o alle cellule tumorali nelle prime fasi della malattia). Un'alternativa utile alle cellule sono le perle accoppiate con lo stesso fluoroforo che viene utilizzato per analizzare il campione. Molte di queste perle sono disponibili in commercio; Queste perle sono premarcate con il fluoroforo desiderato (perle premarcate specifiche per fluorofori)19,20, oppure un anticorpo marcato con fluorescenza può essere attaccato ad esse (perle di cattura degli anticorpi)20,21. Mentre le perle di compensazione commerciali sono disponibili per molti fluorofori, tali perle non sono disponibili per le porfirine, nonostante il loro crescente uso nella ricerca di base e clinica.
Oltre alla conservazione del campione e alle popolazioni positive rispetto a quelle negative opportunamente dimensionate, gli altri vantaggi dell'uso delle perle come controlli di compensazione sono la facilità di preparazione, la bassa fluorescenza di fondo e l'eccellente stabilità nel tempo22. Il potenziale svantaggio dell'uso delle perle come controllo di compensazione è che lo spettro di emissione dell'anticorpo fluorescente catturato sulle perle può differire da quello dello stesso anticorpo utilizzato per etichettare le cellule. Questo può essere di particolare importanza quando si utilizza un citometro a flusso spettrale20. Pertanto, lo sviluppo di perle come controllo di compensazione deve essere eseguito sul citometro a flusso che verrà utilizzato per il test per il quale vengono sviluppate le perle. Inoltre, lo sviluppo delle perle deve includere un confronto con le cellule etichettate con lo stesso reagente colorante fluorescente.
Qui, descriviamo la preparazione di perle di compensazione in polistirene funzionalizzato con ammina TCPP, la cui intensità mediana di fluorescenza nel canale di rilevamento era paragonabile a quella delle cellule marcate con TCPP nell'espettorato e il loro uso come controlli di compensazione per la citometria a flusso. L'autofluorescenza di sfere equivalenti e non funzionalizzate era sufficientemente bassa per il loro uso come controlli di compensazione della fluorescenza negativa. Inoltre, queste perle hanno dimostrato stabilità nello stoccaggio per quasi 1 anno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amber plastic vials, 2 mL, U- bottom, polypropylene</td>
			<td>Research Products International&#160;&#160;</td>
			<td>ZC1028-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine-funtionalized polystyrene divinylbenzene crosslinked (PS/DVB) beads, 10.6 &#956;m diameter, 2.5% w/v aqueous suspension, 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>APX-100-10</td>
			<td>Diameter spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5% w/v 3.82 x 107 beads/mL, 7.11 x 1011 amine groups/ bead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes, 50 mL, Falcon</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>with appropriate rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable polystyrene bottle with cap, 150 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC (N- (3- dimethylaminopropyl)- N&#39;- ethylcarbodiimide hydrochloride), &#8805;98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>03450-1G</td>
			<td>CAS No:&#160; 25952-53-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Single Cell Analysis Software (v10.6.1)</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips, 22 x 22 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass fiber syringe filters (Finneran, 5 &#181;m, 13 mm diameter)</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1190M60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides, 275 x 75 x 1 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol, ACS grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC423830010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical pipette, 1 channel, 100-1000 uL with tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (22- (N- mopholino)- N&#39;- ethanesulfonic acid, hemisodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0164</td>
			<td>CAS No:&#160; 117961-21-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navios EX flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX-40 microscope with DP73 camera and 40X objective with cellSens software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, glass, 5.75&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter (UB 10 Ultra Basic)</td>
			<td>Denver Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller (Drummond)</td>
			<td>Pipete.com</td>
			<td>DP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe, 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Particles (non-functionalized), SPHERO,&#160; 2.5% w/v, 8.0-12.9 &#181;m</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>PP-100-10&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tubes, 15mL, conical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene tubes, round bottom&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainbow Beads (Spherotech URCP-50-2K)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9207381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, disposable - 10 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, disposable - 25 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>CAS No:&#160; 144-55-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCPP (meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine)&#160; Frontier Scientific&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-393-68</td>
			<td>CAS No:&#160; 14609-54-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Spark Plate Reader (or similar)</td>
			<td>Tecan Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube revolver/rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2215365</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyrin-modified beads for use as compensation controls in flow cytometry

La citometria a flusso può rapidamente caratterizzare e quantificare diverse popolazioni cellulari sulla base di misurazioni di fluorescenza. Le cellule vengono prima colorate con uno o più reagenti fluorescenti, ciascuno funzionalizzato con una diversa molecola fluorescente (fluoroforo) che si lega alle cellule selettivamente in base alle loro caratteristiche fenotipiche, come l'espressione dell'antigene della superficie cellulare. L'intensità della fluorescenza da ciascun reagente legato alle cellule può essere misurata sul citometro a flusso utilizzando canali che rilevano una gamma specifica di lunghezze d'onda. Quando vengono utilizzati più fluorofori, la luce dei singoli fluorofori spesso si riversa in canali di rilevamento indesiderati, il che richiede una correzione dei dati di intensità della fluorescenza in un processo chiamato compensazione. 
Le particelle di controllo della compensazione, tipicamente perle polimeriche legate a un singolo fluoroforo, sono necessarie per ogni fluoroforo utilizzato in un esperimento di etichettatura cellulare. I dati delle particelle di compensazione del citometro a flusso vengono utilizzati per applicare una correzione alle misurazioni dell'intensità di fluorescenza. Questo protocollo descrive la preparazione e la purificazione di perle di compensazione del polistirene funzionanti covalentemente con il reagente fluorescente meso-tetra(4-carbossifenil) porfina (TCPP) e la loro applicazione nella compensazione della citometria a flusso. In questo lavoro, le perle di polistirene funzionalizzate con ammina sono state trattate con TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC (N-(3-dimetilamminopropil)-N′-etilcarbodiimmide cloridrato) a pH 6 e a temperatura ambiente per 16 ore con agitazione. Le perle TCPP sono state isolate mediante centrifugazione e risospese in un tampone pH 7 per lo stoccaggio. Il particolato correlato al TCPP è stato osservato come sottoprodotto. Il numero di questi particolati potrebbe essere ridotto utilizzando un protocollo di filtrazione opzionale. Le perle TCPP risultanti sono state utilizzate con successo su un citometro a flusso per la compensazione in esperimenti con cellule di espettorato umano etichettate con più fluorofori. Le perle TCPP si sono dimostrate stabili dopo la conservazione in frigorifero per 300 giorni.

Porphyrins have been of interest for many years in the biomedical field owing to their fluorescence and tumor-targeting properties1,2,3. Therapeutic applications such as photodynamic therapy (PDT) and sonodynamic therapy (SDT) entail the systemic administration of a porphyrin to a cancer patient, the accumulation of the drug in the tumor, and the localized exposure of the tumor to a laser light of a specific wavelength or ultrasound. The exposure to laser light or ultrasound leads to the generation of reactive oxygen species by the porphyrin and subsequent cell death4,5. In photodynamic diagnosis (PDD), porphyrin fluorescence is used to distinguish cancer cells from normal cells6. In this context, protoporphyrin IX, a natural fluorescent porphyrin that accumulates in tumors upon the systemic or local injection of its precursor, 5-aminolevulinic acid (5-ALA), is used to identify gastrointestinal stromal tumors, bladder cancer, and brain cancer7,8. More recently, 5-ALA treatment was explored as an approach to detect minimal residual disease in multiple myeloma9. Our laboratory has been using the tetraaryl porphyrin TCPP (5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-21,23H-porphine) for its ability to selectively stain lung cancer cells and cancer-associated cells in human sputum samples, which is a property that has been exploited in slide-based and flow cytometric diagnostic assays10.
Some porphyrins are bifunctional in that they can be used as therapeutic and diagnostic agents2,11. In biomedical research, such bifunctional porphyrins are used to evaluate how their ability to selectively target and kill cancer cells is a function of their structure as well as how it is affected by the presence of other compounds12,13,14,15,16. Both the cellular uptake of porphyrins and their cytotoxicity can be measured on a flow cytometric platform in a high-throughput manner. The absorption and emission spectra of fluorescent porphyrins are complex, but most flow cytometric platforms are equipped to correctly identify them. The absorption spectrum of fluorescent porphyrins is characterized by a strong absorption band in the 380-500 nm range, known as the Soret band. Two to four weaker absorption bands are generally observed in the 500-750 nm range (Q bands)17. A blue&#160;488 nm laser, present in most flow cytometers, or a violet laser (405 nm) can generate light of the appropriate wavelength to excite porphyrins. The emission spectra of porphyrins typically display peaks in the 600-800 nm range18, which results in very little spectral overlap with fluorescein isothiocyanate or phycoerythrin (PE) fluorophores but considerable overlap with other often-used fluorophores, such as allophycocyanin (APC), as well as tandem fluorophores, such as PE-Cy5 and others. Therefore, when using porphyrins in multi-color flow cytometry assays, single-fluorophore controls are essential to adequately correct the spillover of fluorescence in channels other than the one designated to measure the porphyrin&#39;s fluorescence.
Ideally, the single-fluorophore controls used to calculate the spillover matrix for a panel of fluorophores (also called &#34;compensation controls&#34;) should consist of the same cell type(s) as the sample. However, using the sample for this purpose is not optimal if there is very little sample to begin with or if the target population within the sample is very small&#160;(for example, if one wants to look at minimal residual disease or cancer cells at the early stages of the disease). A useful alternative to cells is beads coupled with the same fluorophore that is used to analyze the sample. Many such beads are commercially available; these beads are either prelabeled with the desired fluorophore (prelabeled fluorophore-specific beads)19,20, or a fluorescently labeled antibody can be attached to them (antibody capture beads)20,21. While commercial compensation beads are available for many fluorophores, such beads are unavailable for porphyrins, despite their increasing use in basic and clinical research.
In addition to sample preservation and appropriately sized positive versus negative populations, the other advantages of using beads as compensation controls are the ease of preparation, low background fluorescence, and excellent stability over time22. The potential disadvantage of using beads as a compensation control is that the emission spectrum of the fluorescent antibody captured on beads may differ from that of the same antibody used to label the cells. This may be of specific importance when using a spectral flow cytometer20. Therefore, the development of beads as a compensation control needs to be performed on the flow cytometer that will be used for the assay for which the beads are developed. Moreover, the development of the beads needs to include a comparison with cells labeled with the same fluorescent staining reagent.
Here, we describe the preparation of TCPP amine-functionalized polystyrene compensation beads, whose median fluorescence intensity in the detection channel was comparable to that of TCPP-labeled cells in sputum, and their use as compensation controls for flow cytometry. The autofluorescence of equivalent, non-functionalized beads was sufficiently low for their use as negative fluorescence compensation controls. In addition, these beads demonstrated stability in storage for nearly 1 year.

Autore in primo piano: Perle modificate con porfirina da utilizzare come controlli di compensazione nella citometria a flusso  

Perle modificate con porfirina da utilizzare come controllo di compensazione nella citometria a flusso

Questo protocollo per l'etichettatura TCPP delle perline è relativamente veloce ed efficiente. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo del processo di marcatura delle perline TCPP determinato dalla citometria a flusso. La Figura 1A mostra il profilo standardizzato delle perline arcobaleno, come rilevato nel canale appropriato per il rilevamento di TCPP. Queste perle servono come QC per la standardizzazione delle tensioni laser per il rilevamento di TCPP...

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Il protocollo descrive come le sfere di compensazione a base di porfirina per la citometria a flusso vengono preparate dalla reazione di perle di polistirene funzionalizzato con la porfirina TCPP e il reagente di accoppiamento ammidico EDC. Una procedura di filtrazione viene utilizzata per ridurre i sottoprodotti del particolato.

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or ...

Abbiamo sviluppato perle di polistirene modificate con la porfirina TCPP come controllo di compensazione e citometria a flusso multicolore. Le perle utilizzate in questo protocollo hanno un'intensità di fluorescenza paragonabile alle cellule di colorazione TCPP e passano ancora attraverso il citometro a flusso. Ci siamo riusciti e stiamo attualmente lavorando su metodi migliori per rimuovere il sottoprodotto del particolato.Le perle di compensazione modificate con porfirina erano preferibili alle celle colorate con TCPP come controlli di compensazione. Queste velocità sono rimaste stabili per mesi senza una significativa perdita di fluorescenza. Le porfirine sono note per colorare selettivamente le cellule tumorali.La ricerca combina la selettività delle porfirine con la citometria a flusso quantitativa come potente piattaforma per l'analisi ad alto rendimento di campioni umani.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Porphyrin-Modified Beads for Use as Compensation Controls in Flow Cytometry

1.4K Views.  bioAffinity Technologies. Abbiamo sviluppato perle di polistirene modificate con la porfirina TCPP come controllo di compensazione e citometria a flusso multicolore. Le perle utilizzate in questo protocollo hanno un'intensità di fluorescenza paragonabile alle cellule di colorazione TCPP e passano ancora attraverso il citometro a flusso. Ci siamo riusciti e stiamo attualmente lavorando su metodi migliori per rimuovere il sottoprodotto del particolato.Le perle di compensazione modificate con porfirina erano pref...

Video: Autore in primo piano: Perle modificate con porfirina da utilizzare come controlli di compensazione nella citometria a flusso  

Flow cytometry can rapidly characterize and quantify diverse cell populations based on fluorescence measurements. The cells are first stained with one or more fluorescent reagents, each functionalized with a different fluorescent molecule (fluorophore) that binds to cells selectively based on their phenotypic characteristics, such as cell surface antigen expression. The intensity of fluorescence from each reagent bound to cells can be measured on the flow cytometer using channels that detect a specified range of wavelengths. When multiple fluorophores are used, the light from individual fluorophores often spills over into undesired detection channels, which requires a correction to the fluorescence intensity data in a process called compensation. 
Compensation control particles, typically polymer beads bound to a single fluorophore, are needed for each fluorophore used in a cell labeling experiment. Data from compensation particles from the flow cytometer are used to apply a correction to the fluorescence intensity measurements. This protocol describes the preparation and purification of polystyrene compensation beads covalently functionalized with the fluorescent reagent meso-tetra(4-carboxyphenyl) porphine (TCPP) and their application in flow cytometry compensation. In this work, amine-functionalized polystyrene beads were treated with TCPP and the amide coupling reagent EDC (N-(3-dimethylaminopropyl)-N&#8242;-ethylcarbodiimide hydrochloride) at pH 6 and at room temperature for 16 h with agitation. The TCPP beads were isolated by centrifugation and resuspended in a pH 7 buffer for storage. TCPP-related particulates were observed as a byproduct. The number of these particulates could be reduced using an optional filtration protocol. The resultant TCPP beads were successfully used on a flow cytometer for compensation in experiments with human sputum cells labeled with multiple fluorophores. The TCPP beads proved stable following storage in a refrigerator for 300 days.

The protocol describes how porphyrin-based compensation beads for flow cytometry are prepared by the reaction of amine-functionalized polystyrene beads with the porphyrin TCPP and the amide coupling reagent EDC. A filtration procedure is used to reduce the particulate byproducts.