Questo lavoro è stato sostenuto dall'Amministrazione provinciale di medicina tradizionale cinese del Sichuan (2021YJ0175) e dal Progetto di innovazione della ricerca universitaria della Scuola di medicina clinica (LCYJSKT2023-11), Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu.

Il protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato Etico Animale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Numero di registrazione: 2020-34). I topi femmina C57BL/6J (12 settimane, n = 14) sono stati divisi in due gruppi in modo casuale, un gruppo operato in modo fittizio (gruppo Sham, n = 7) e un gruppo modello (gruppo OVX, n = 7). Gli animali sono stati acquistati da un fornitore commerciale (vedi Tabella dei materiali). Tutti i topi sono stati tenuti in gabbie individuali a 22-26 °C con il 45%-55% di umidità, hanno potuto adattarsi al loro nuovo ambiente per 1 settimana e hanno avuto libero accesso all'acqua e alla dieta. Tutti gli studi sperimentali sugli animali sono stati condotti presso l'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.
1. Preparazione di modelli animali
<ol><li>Anestetizzare il topo di 12 settimane mediante iniezione intraperitoneale con Avertin all'1,25% (Tribromoetanolo in alcol terz-amilico, vedere Tabella dei materiali) alla dose di 0,02 mL/g. Posizionare il topo prono su un tavolo operatorio chirurgico sterile e immobilizzare gli arti fissandoli con del nastro adesivo.</li>
	<li>Utilizzare le forbici (vedere la tabella dei materiali) per tagliare i peli che potrebbero influire sull'operazione chirurgica. NOTA: Si raccomanda di evitare danni alla pelle durante la preparazione del sito chirurgico.</li>
	<li>Lavarsi accuratamente le mani e indossare guanti chirurgici. Disinfettare la schiena del topo tre volte con iodopovidone (vedere la tabella dei materiali) e utilizzare una garza medica (vedere la tabella dei materiali) per asciugarla. NOTA: Sii prudente; Bagnare troppo i capelli durante la disinfezione può portare a ipotermia postoperatoria nei topi.</li>
	<li>Praticare un'incisione lunga circa 0,5-1,0 cm, situata a 1 cm di distanza da un terzo della linea mediana del dorso del topo, utilizzando un bisturi (vedere la tabella dei materiali). Separare delicatamente la fascia e tagliare il muscolo con le forbici per tessuti (vedi Tabella dei materiali) fino a quando l'ovaio non è visibile. Legare i vasi sanguigni circostanti con punti di sutura non assorbibili (vedere la tabella dei materiali) e rimuovere l'ovaio.</li>
	<li>Risciacquare la cavità con soluzione salina allo 0,9%, quindi suturare separatamente la pelle, il muscolo e la fascia (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Ripeti la stessa sequenza di passaggi sull'altro lato.</li>
	<li>Rimuovere il grasso periovarico delle stesse dimensioni dell'ovaio ed eseguire la stessa procedura chirurgica sopra menzionata per i passaggi rimanenti per stabilire il modello operato fittizio.</li>
	<li>Prevedere un periodo di recupero di 1 settimana dopo l'intervento. Dopo 8 settimane, i modelli murini osteoporotici saranno stabiliti con successo 9,10.</li>
</ol>2. Scansione micro-CT
<ol><li>Sopprimere il topo per inalazione di CO2 in eccesso. Rimuovere quanto più tessuto molle possibile dal femore del topo dopo l'eutanasia e ottenere un nuovo campione per la scansione. NOTA: Sebbene non esista una soluzione perfetta per la conservazione dei campioni, è possibile adottare alcune misure per massimizzare la qualità dei risultati della scansione Micro-CT. Prima del fissaggio, fare attenzione a rimuovere quanto più tessuto circostante possibile. La formalina o formalina tamponata è il metodo di fissazione preferito con conservazione in PBS11,12.</li>
	<li>Fare doppio clic sull'icona del software del sistema di imaging micro-CT sul desktop per avviare il sistema (vedere Tabella dei materiali). Selezionare un piano campione compatibile con il campo visivo (FOV) del campione di 18 mm x 18 mm. Caricare il piano campione appropriato nella macchina e chiudere il portello.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Riscaldamento nel Pannello di controllo. NOTA: È stato necessario un breve tempo di riscaldamento. Non tentare di aprire il portello durante la generazione di raggi X. Controllare la spia X-Ray On sul pannello anteriore e sul monitor del computer per confermare se vengono generati raggi X.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Menu per impostare un nuovo database, quindi creare un nuovo campione e un nuovo studio.</li>
	<li>Selezionare Manuale dall'elenco a discesa Menu e immettere valori di tensione e corrente personalizzati nel Pannello di controllo. Impostare Tensione (kV) su 90, Corrente (μA) su 80, Modalità di scansione su Alta risoluzione, 14 min e FOV (mm) su 18 mm x 18 mm. NOTA: Fare riferimento al manuale per i diversi sistemi micro CT per impostare i parametri appropriati.</li>
	<li>Posizionare l'osso in modo sicuro con una pellicola di plastica nel letto del campione. Chiudere il portello. Assicurarsi che il soggetto sia centrato con precisione nella finestra X-capture premendo i pulsanti di regolazione sulla macchina. NOTA: La regolazione del campione deve essere lenta e delicata per evitare che cada accidentalmente nella macchina.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Start per avviare la scansione TC.</li>
</ol>3. Analisi dei dati TC
<ol><li>Entrare nel software (vedi Tabella dei Materiali) e selezionare i dati da analizzare. Fare clic su Sub e impostare Dimensione pixel su 10 μm. Spostare e ridimensionare la regione di interesse (ROI) per includere il femore distale sopra la placca di crescita. Fare clic su Start (vedere la Figura 1). NOTA: La dimensione dei pixel di ricostruzione del sottovolume è stata selezionata a 10 μm poiché lo spessore delle trabecole di imaging è stato stimato in circa 20-30 μm sulla base dei dati istologici di studi precedenti13. Se il rapporto segnale/rumore è insufficiente per l'elaborazione dei dati, è necessario eseguire una scansione ad alta risoluzione di 1 ora.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Analisi 3D per ottenere la ricostruzione 3D risultante.</li>
	<li>Esportare i dati dal sistema micro-CT al computer per l'analisi.</li>
	<li>Importare i dati TC ricostruiti. Fare clic su Elabora > Calcolatrice immagine, quindi fare clic su Pad regione > Interattivo. Regolare la casella di controllo gialla in base al ROI appropriato. NOTA: La regione di interesse (ROI) inizia a circa 540 μm prossimale rispetto alla placca di crescita e si estende di 1600 μm prossimalmente per valutare l'effettivo metabolismo osseo e il rimodellamento.</li>
	<li>Selezionare l'add-on Bone Microarchitecture Analysis (BMA) (vedere la tabella dei materiali). Fare clic su Segmenta corteccia , quindi su Segmenta trabecole. NOTA: Sia l'osso trabecolare che l'osso corticale vengono selezionati automaticamente. Normalmente non è necessaria alcuna regolazione manuale.</li>
	<li>Fare clic su Salva mappa oggetto finale e quindi fare clic su Misura osso per calcolare gli indici morfometrici ossei. NOTA: Qui è stata calcolata solo la densità minerale ossea relativa (BMD) poiché non è stato aggiunto alcun controllo.</li>
</ol>4. Decalcificazione del tessuto osseo
<ol><li>Fissare i campioni ossei in paraformaldeide al 4% (vedi Tabella dei Materiali) per 24 ore. Lavare i campioni tre volte con PBS (vedi Tabella dei materiali) per 20 minuti ogni volta.</li>
	<li>Sciacquare il fazzoletto tre volte con acqua distillata per 20 minuti ogni volta. Trasferire il tessuto in una soluzione di decalcificazione contenente EDTA (vedere Tabella dei materiali) e decalcificare per 30 giorni con un cambio di soluzione settimanale fino al punto finale. NOTA: La puntura dell'ago, il pizzicamento della mano e il clampaggio vengono utilizzati per terminare la decalcificazione quando il tessuto osseo diventa morbido o non c'è alcun senso di resistenza durante l'agugliatura. Il metodo fisico di rilevamento può causare alcuni danni alla struttura del tessuto, quindi cerca di evitare una forza eccessiva o test ripetuti.</li>
	<li>Estrarre il tessuto dal fissativo e utilizzare un bisturi per tagliare il tessuto in una cappa aspirante. Metti il fazzoletto tagliato e l'etichetta corrispondente in una scatola di disidratazione.</li>
	<li>Mettere la scatola di disidratazione in un cestello e disidratarla in un processatore di tessuti (vedi Tabella dei materiali) con alcool a gradiente (etanolo al 75% per 4 ore, etanolo all'85% per 2 ore, etanolo al 90% per 2 ore, etanolo al 95% per 1 ora, etanolo anidro per 30 min, etanolo anidro II per 30 min, xilene I per 5-10 min, xilene II per 5-10 min, cera I per 1 ora, cera II per 1 ora, cera III per 1 ora).</li>
	<li>Utilizzare una macchina per l'inclusione (vedere la tabella dei materiali) per incorporare il tessuto imbevuto di cera. Versare la cera fusa in una scatola di inclusione e posizionare il tessuto dalla scatola di disidratazione prima che la cera si indurisca.</li>
	<li>Orientare il tessuto in base alla superficie di inclusione e applicare l'etichetta corrispondente. Raffreddare su un tavolo di congelamento a -20 °C (vedi Tabella dei materiali). Rimuovere il blocco di cera dalla scatola di inclusione dopo la solidificazione e tagliare il blocco di cera secondo necessità (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Tagliare il blocco di cera rifilato in vetrini di 3 μm di spessore su un microtomo (vedi Tabella dei materiali). Far galleggiare i vetrini su acqua tiepida a 40 °C su una macchina per la stesura di fazzoletti (vedere la tabella dei materiali) per appiattire il tessuto e raccoglierli con un vetrino.</li>
	<li>Cuocere in forno a 60 °C (vedi Tabella dei materiali) fino a quando l'acqua non evapora e la cera si scioglie. Estrarre e conservare a temperatura ambiente (RT) per un uso successivo.</li>
</ol>5. Colorazione HE
<ol><li>Mettere i vetrini in xilene I per 20 minuti, poi in xilene II per 20 minuti. Inoltre, immergere i vetrini in etanolo anidro I ed etanolo anidro II per 5 minuti ciascuno, alcol al 75% per 5 minuti, quindi lavare i vetrini con acqua di rubinetto (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Incubare in ematossilina (vedere la tabella dei materiali) per 3-5 minuti. Differenziare i campioni con una soluzione di acido cloridrico (vedere Tabella dei materiali). Trattare i vetrini con una soluzione di ammoniaca (vedere la tabella dei materiali) per l'azzurratura, quindi lavare i vetrini con acqua.</li>
	<li>Mettere i vetrini in alcool all'85% e al 95% per la disidratazione e colorare con una soluzione di eosina (vedi Tabella dei materiali) per 5 minuti.</li>
	<li>Immergere i vetrini in etanolo anidro I per 5 minuti, etanolo anidro II per 5 minuti ed etanolo anidro III per 5 minuti. Trattare i vetrini con xilene I per 5 minuti, xilene II per 5 minuti e montare con balsamo neutro (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Esamina ogni vetrino al microscopio. Quindi, scegliere le sezioni rappresentative per la scansione panoramica (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Per ogni campione sono necessarie almeno tre fette consecutive. Prima della scansione panoramica, le fette devono essere esaminate al microscopio per assicurarsi che siano complete e chiare. Assicurarsi che la cavità del midollo osseo, l'osso corticale e l'osso spongioso siano completamente visualizzati e che siano visibili diversi tipi di cellule ossee.</li>
</ol>6. Analisi dell'immagine HE
<ol><li>Aprire le immagini HE con il software CaseViewer (vedere Tabella dei materiali). Selezionare l'area di interesse (ROI) nella diapositiva e salvarla come immagine a colori. NOTA: La selezione del ROI è coerente con il software sopra menzionato.</li>
	<li>Aprire l'immagine in ImageJ (vedere Tabella dei materiali). Selezionate lo strumento Bacchetta dalla barra degli strumenti. Fare clic sull'osso trabecolare.</li>
	<li>Regolare la tolleranza e le impostazioni contigue in base alle esigenze. Andare a Regolazioni > immagine > Bianco e nero e fare clic su OK. Ripeti i passaggi per altre aree dell'osso.</li>
	<li>Inverti la selezione e riempila di colore bianco. Salvare l'immagine come maschera per l'analisi (vedere la Figura 2). NOTA: Per la metodologia dettagliata, fare riferimento al lavoro pubblicato in precedenza14.</li>
	<li>Aprire la maschera nel software di analisi15,16 (vedi Tabella dei materiali). Esegui Elabora > binario > Crea binario per convertire l'immagine a colori in un'immagine binaria.</li>
	<li>Utilizzare il plug-in 17 (vedi Tabella dei materiali) nel software per analizzare i parametri strutturali: Run Area/Volume Fraction per calcolare il volume osseo al volume totale dell'osso (BV/TV [%])18,19. NOTA: Questo metodo è applicabile per le trabecole ossee e il midollo osseo, riempiendo l'intero ROI nelle immagini HE.</li>
</ol>

Colorazione HE e micro-TC per valutare la microarchitettura dell'osso trabecolare murino

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+osteoporosis+in+China,+a+community+based+cohort+study+of+osteoporosis.">The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis.</a> Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).</li><li>Stein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+animal+experiments+are+still+indispensable+in+bone+research:+A+statement+by+the+European+Calcified+Tissue+Society.">Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).</li><li>Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., F&#246;ger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+bone+microstructure+by+micro+CT+in+C57BL/6J+mice+for+sex-specific+differentiation.">Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).</li><li>Fonseca, H., Moreira-Gon&#231;alves, D., Coriolano, H. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'osteoporosi può portare a fratture frequenti, che sono costose, possono causare dolore, disabilità o addirittura la morte e compromettere seriamente la qualità della vita dei pazienti20. Nel corso degli anni, il modello di ovariectomia è stato riconosciuto come uno dei metodi standard per lo studio dell'osteoporosi21. Il modello animale preclinico più comune per l'osteoporosi è il ratto ovariectomizzato (OVX). Nonostante ciò, la maggior parte della ricerca sui mecc...

L'osteoporosi è una malattia metabolica ossea prevalente, soprattutto tra gli anziani, ed è associata ad un aumentato rischio di fratture da fragilità. Man mano che l'osteoporosi diventa più comune in Cina1, ci sarà una crescente domanda per lo studio delle strutture ossee di piccoli animali 2,3. I metodi precedenti di misurazione della perdita ossea si basano sui risultati dell'assorbimetria bidimensionale a raggi X a doppia energia. Tuttavia, questo non cattura i cambiamenti nella microstruttura architettonica dell'osso trabecolare, che è un fattore chiave per la forza scheletrica4. La microstruttura dell'osso influisce sulla sua forza, rigidità e resistenza alla frattura. Confrontando la microarchitettura ossea in condizioni normali e patologiche, è possibile identificare i cambiamenti nella morfologia, nella struttura e nella funzione del tessuto osseo causati dall'osteoporosi. Queste informazioni contribuiscono alla comprensione dello sviluppo dell'osteoporosi e della sua associazione con altre malattie.
L'imaging con micro-tomografia computerizzata (Micro-CT) è recentemente diventato una tecnica popolare per la valutazione della morfologia ossea, in grado di fornire dati accurati e completi sulla struttura ossea e sui parametri di densità come la frazione di volume osseo, lo spessore e la separazione 5,6. Allo stesso tempo, i risultati della Micro-CT possono essere influenzati dal software di analisi7. Diversi metodi di acquisizione, valutazione e refertazione delle immagini sono utilizzati da vari sistemi Micro-CT commerciali. Questa incoerenza rende difficile confrontare e interpretare i risultati riportati da diversi studi5. Inoltre, attualmente non può sostituire l'istomorfometria ossea nel fornire ai ricercatori informazioni sui parametri a livello cellulare nel sistema scheletrico8. Nel frattempo, le tecniche istologiche consentono l'osservazione diretta e la misurazione della morfologia microscopica dell'osso. La colorazione con ematossilina ed eosina (HE) è una tecnica di colorazione comune utilizzata in istologia per visualizzare la struttura generale di cellule e tessuti. Viene utilizzato per identificare la presenza di tessuto osseo e la sua microarchitettura.
Questo articolo utilizza la Micro-CT combinata con la tecnica di taglio dei tessuti (colorazione ematossilina-eosina [HE]) per raccogliere immagini di tessuto osseo ed eseguire analisi quantitative dell'osso trabecolare per valutare i cambiamenti della microstruttura ossea in un modello murino di osteoporosi.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia Solution</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2021070101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyze 12.0</td>
			<td>AnalyzeDirect, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anatomical Forceps</td>
			<td>Jinzhong surgical instrument Co., Ltd</td>
			<td>J3C030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Dyeing Machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Varistain&#8482; Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone Microarchitecture Analysis Add-on</td>
			<td>AnalyzeDirect, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier Slides</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co.</td>
			<td>220518001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decalcification Solution</td>
			<td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CR2203047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Scissors</td>
			<td>Jinzhong surgical instrument Co., Ltd</td>
			<td>ZJA010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding box marking machine</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>&#160;PrintMate AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji: ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Film Sealer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>Autostainer 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Table</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JB-L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H&#38;E Staining Kit</td>
			<td>Leagene</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid Solution</td>
			<td>Sichuan Xilong Science Co., Ltd</td>
			<td>210608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ2 Plugin</td>
			<td></td>
			<td>BoneJ 7.0.16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Gauze</td>
			<td>Shandong Ang Yang Medical Technology Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures</td>
			<td>Ethicon, Inc.</td>
			<td>SA84G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Jinzhong surgical instrument Co., Ltd</td>
			<td>J32010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Balsam</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9240A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANNORAMIC Digital Slide Scanners</td>
			<td>3DHISTECH Ltd.&#160;</td>
			<td>PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine solution 5%</td>
			<td>Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum GX2 microCT Imaging System</td>
			<td>PerkinElmer, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd</td>
			<td>20170022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scan &#38; Browse Software</td>
			<td>3DHISTECH Ltd.&#160;</td>
			<td>CaseViewer2.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves</td>
			<td>Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd</td>
			<td>22B141EO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride Solution 0.9%</td>
			<td>Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hypodermic Syringes for Single Use</td>
			<td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Products&#160; Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Medical Suture Needles</td>
			<td>Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>PW8068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Spreading and Baking Machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JK-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>M2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax Trimmer</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd</td>
			<td>JXL-818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd</td>
			<td>2022051901</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trabecular bone microarchitecture evaluation in an osteoporosis mouse model

La microstruttura ossea si riferisce alla disposizione e alla qualità del tessuto osseo a livello microscopico. Comprendere la microstruttura ossea dello scheletro è fondamentale per comprendere la fisiopatologia dell'osteoporosi e migliorarne il trattamento. Tuttavia, la manipolazione di campioni ossei può essere complessa a causa delle loro proprietà dure e dense. In secondo luogo, il software specializzato rende difficile l'elaborazione e l'analisi delle immagini. In questo protocollo, presentiamo una soluzione economica e facile da usare per l'analisi della microstruttura ossea trabecolare. Vengono forniti passaggi e precauzioni dettagliati. La micro-CT è una tecnica di imaging tridimensionale (3D) non distruttiva che fornisce immagini ad alta risoluzione della struttura ossea trabecolare. Consente la valutazione obiettiva e quantitativa della qualità ossea, motivo per cui è ampiamente considerato il metodo gold standard per la valutazione della qualità ossea. Tuttavia, l'istomorfometria rimane indispensabile in quanto offre parametri cruciali a livello cellulare, colmando il divario tra le valutazioni bidimensionali (2D) e 3D dei campioni ossei. Per quanto riguarda le tecniche istologiche, abbiamo scelto di decalcificare il tessuto osseo per poi eseguire l'inclusione tradizionale della paraffina. In sintesi, la combinazione di questi due metodi può fornire informazioni più complete e accurate sulla microstruttura ossea.

Osteoporosis is a prevalent metabolic bone disease, especially among the elderly, and is associated with an increased risk of fragility fractures. As osteoporosis becomes more common in China1, there will be a growing demand for studying the bone structures of small animals2,3. The previous methods of measuring bone loss rely on the outcomes of two-dimensional dual-energy x-ray absorptiometry. However, this does not capture the changes in the architectural microstructure of the trabecular bone, which is a key factor for skeletal strength4. The microstructure of bone affects its strength, stiffness, and fracture resistance. By comparing bone microarchitecture in normal and pathological states, changes in bone tissue morphology, structure, and function caused by osteoporosis can be identified. This information contributes to the understanding of the development of osteoporosis and its association with other diseases. 
Micro-computed tomography (Micro-CT) imaging has recently become a popular technique for bone morphology assessment, where it can provide accurate and comprehensive data on bone structure and density parameters such as bone volume fraction, thickness, and separation5,6. At the same time, the Micro-CT results can be affected by the analysis software7. Different methods of image acquisition, evaluation, and reporting are used by various commercial Micro-CT systems. This inconsistency makes it hard to compare and interpret the results reported by different studies5. Also, it cannot currently replace bone histomorphometry in providing researchers with information on cellular-level parameters in the skeletal system8. Meanwhile, histologic techniques allow direct observation and measurement of the microscopic morphology of bone. Hematoxylin and eosin (HE) staining is a common staining technique used in histology to visualize the general structure of cells and tissues. It is used to identify the presence of bone tissue and its microarchitecture.
This article uses Micro-CT combined with tissue slicing technique (Hematoxylin-Eosin [HE] staining) to collect bone tissue images and perform quantitative analysis of trabecular bone to evaluate the changes of bone microstructure in an osteoporosis mouse model.

Autore in primo piano: Un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello di osteoporosi murina 

Valutazione della microarchitettura dell'osso trabecolare in un modello murino di osteoporosi

Our research focused on the effects of traditional Chinese medicine, or TCM, on osteoporosis. We are trying to explore the mechanism, efficacy, and safety of TCM intervention for osteoporosis. Micro-computed tomography imaging has recently become a popular technique for bone morphology assessment.It can provide accurate and comprehensive data on bone structure and density parameters, such as bone volume, fracture thickness, and separation. The skeletal system is the most unique tissue structure in terms of the physical properties of the body. It contains the inorganic component arginine calcium phosphate, and it is hard and stiff as a result.The process of hurting bone symptoms is tedious. We provided a complete and detailed process from modeling to osteoporosis in evaluation for researchers. We believe the application of the technology will undoubtedly bring great improvements to osteoporosis research in the context of ethnomedicine exploration.

Analisi Micro-CT Sono stati misurati i parametri microarchitettonici trabecolari nei topi di entrambi i gruppi e sono stati riportati i loro valori medi e le SD nella Tabella 1. La distribuzione di alcuni parametri (ad esempio, il rapporto tra il volume osseo e il volume totale del tessuto, lo spessore trabecolare, la separazione trabecolare) all'interno di ciascun gruppo è illustrata nella Figura 3.
...

Watch this Scientific Journal Video about An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model at JoVE.com

Questo protocollo presenta un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello murino di osteoporosi combinando tecniche di colorazione ematossilina-eosina (HE) e micro-tomografia computerizzata (Micro-CT).

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...

La nostra ricerca si è concentrata sugli effetti della medicina tradizionale cinese, o MTC, sull'osteoporosi. Stiamo cercando di esplorare il meccanismo, l'efficacia e la sicurezza dell'intervento di MTC per l'osteoporosi. L'imaging con tomografia microcomputerizzata è recentemente diventato una tecnica popolare per la valutazione della morfologia ossea.È in grado di fornire dati accurati e completi sulla struttura ossea e sui parametri di densità, come il volume osseo, lo spessore della frattura e la separazione. Il sistema scheletrico è la struttura tissutale più unica in termini di proprietà fisiche del corpo. Contiene il componente inorganico arginina fosfato di calcio ed è duro e rigido di conseguenza.Il processo di lesione dei sintomi ossei è noioso. Abbiamo fornito un processo completo e dettagliato dalla modellazione all'osteoporosi nella valutazione per i ricercatori. Crediamo che l'applicazione della tecnologia porterà senza dubbio grandi miglioramenti alla ricerca sull'osteoporosi nel contesto dell'esplorazione etnomedica.

trabecular-bone-microarchitecture-evaluation-an-osteoporosis-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

1.4K Views.  Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. La nostra ricerca si è concentrata sugli effetti della medicina tradizionale cinese, o MTC, sull'osteoporosi. Stiamo cercando di esplorare il meccanismo, l'efficacia e la sicurezza dell'intervento di MTC per l'osteoporosi. L'imaging con tomografia microcomputerizzata è recentemente diventato una tecnica popolare per la valutazione della morfologia ossea.È in grado di fornire dati accurati e completi sulla struttura ossea e sui parametri di densità, come il volume osseo, lo spessore...

Video: Autore in primo piano: Un metodo economico ed efficiente per la valutazione quantitativa della microarchitettura ossea in un modello di osteoporosi murina 

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton is crucial for gaining insight into the pathophysiology of osteoporosis and improving its treatment. However, handling bone samples can be complex due to their hard and dense properties. Secondly, specialized software makes image processing and analysis difficult. In this protocol, we present a cost-effective and easy-to-use solution for trabecular bone microstructure analysis. Detailed steps and precautions are provided. Micro-CT is a non-destructive three-dimensional (3D) imaging technique that provides high-resolution images of trabecular bone structure. It allows for the objective and quantitative evaluation of bone quality, which is why it is widely regarded as the gold standard method for bone quality assessment. However, histomorphometry remains indispensable as it offers crucial cellular-level parameters, bridging the gap between two-dimensional (2D) and 3D assessments of bone specimens. As for the histologic techniques, we chose to decalcify the bone tissue and then perform traditional paraffin embedding. In summary, combining these two methods can provide more comprehensive and accurate information on bone microstructure.

This protocol presents an economical and efficient method for quantitative evaluation of bone microarchitecture in a mouse model of osteoporosis by combining Hematoxylin-Eosin (HE) staining and micro-computed tomography (Micro-CT) techniques.

Ricerca

Medicina

Micro-Computed Tomography (CT) Imaging of Murine Trabecular Bone

To begin the micro-computed tomography, or micro CT imaging, remove as much soft tissue as possible from the bone. Open the micro CT imaging system software by double-clicking its icon on the computer. Select the sample bed compatible with the sample field of view, or FOV, of 18 millimeters by 18 millimeters.Load the sample bed into the machine and close the hatch. In the Control Panel, select Manual in the preset option in the Scan Acquisition Settings. Set Voltage kilovolts to 90, Current microamperes to 80, Scan Mode to high resolution 14 minutes, and FOV millimeters to 18 millimeters by 18 millimeters.Position the bone securely with plastic film in the sample bed and close the hatch. Click on the Live button to observe the sample. And using the adjustment buttons on the machine, center the subject precisely in the X-capture window.Click the Start button to start the CT scan.

Imaging con tomografia microcomputerizzata (TC) dell'osso trabecolare murino

Analyzing Micro-Computed Tomography (CT) Images of Murine Trabecular Bone

To begin analyzing the micro-computed tomography, or micro CT images, in the micro CT imaging system software, select the data to be analyzed. Click Sub, and set pixel size to 10 microns. Move and resize the region of interest, or ROI, to include the distal femur above the growth plate.Then, click on Start. Next, click the Analysis 3D button to get the resulting 3D reconstruction. Export the data from the micro CT system to the computer for analysis.After importing the reconstructed CT data, click Process and Image Calculator. Then sequentially click Region Pad and Interactive. Adjust the yellow check box to the appropriate ROI.After exiting the image calculator, select the bone microarchitecture analysis, or BMA add-on, and click Segment Cortex and Segment Trabeculae. Finally, click on Measure Bone to calculate the bone morphometric indices. The trabecular micro-architectural parameters were measured in mice from two groups, the sham-operated group and the ovariectomized osteoporosis model group, or OVX group.The results indicated significant differences between mice of the two groups. The ratio of bone volume to total tissue volume in the OVX group was 3%lower than that in the sham group. The trabecular thickness in mice of the OVX group was lower than in the sham group, and the trabecular separation in the OVX mice was greater than that in the sham mice.3D displays of trabecular ROIs extracted from reconstructed bone volume revealed that compared to the sham group, in the OVX mice, the trabeculae was sparse and showed osteoporosis.

Analisi delle immagini di tomografia microcomputerizzata (TC) dell'osso trabecolare murino

Analyzing the Hematoxylin-Eosin (HE) Images of Murine Trabecular Bone Tissue

To begin analysis of the Hematoxylin and Eosin or HE images of the mouse bone tissue, open the HE images with case viewer software. Select the region of interest or ROI on the slide and save it as a color image. Then open the image in image J.Select the wand tool from the toolbar, and click on the trabecular bone.To adjust the tolerance and contiguous settings as needed, go to image, then adjustments, followed by black and white. And click okay. Repeat the steps for other areas of the bone.Invert the selection and fill it with white color. Sequentially click on process binary and convert to mask to convert the color image to a binary image. Use a plugin in the software to analyze structural parameters.Run area by volume fraction to calculate bone volume to total volume of bone. The histopathological analysis performed by HE staining of mice femur showed the trabecular bones under the growth plate of the distal femur were reduced in the ovariectomized osteoporosis model mice when compared to the sham operated group. The quantitative analysis of tissue sections also indicated that the OVX mice had less trabecular bone area than those in the sham group.