Questo protocollo descrive come le larve transgeniche di zebrafish possono essere utilizzate per fornire un saggio quantitativo in vivo della vascolarizzazione dello xenografto tumorale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche precedenti è che consente allo sperimentatore di quantificare accuratamente i cambiamenti nei livelli di vascolarizzazione dello xenografto. Il passo chiave è garantire che le cellule tumorali vengano iniettate correttamente nelle larve di zebrafish in modo che le successive fasi di imaging e quantificazione non siano compromesse.
Dopo aver cresciuto ed etichettato le cellule B16-F1 con colorante fluorescente, inizia a preparare embrioni per l'impianto. Riempire un piatto da 35 millimetri con una soluzione al 2% di metilcellulosa in E3 a un quarto del volume del piatto. Utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare circa 50 embrioni transgenici precedentemente preparati sulla metilcellulosa riducendo al minimo il volume della soluzione E3 trasferita.
Usando una punta di pipetta microcapillare, disporre gli embrioni in modo che siano tutti orientati verticalmente con la testa verso l'alto, la coda verso il basso e l'embrione con il lato sinistro verso l'alto. Aggiungere il 50%ECM a un pellet di cellule B16-F1 preparato in precedenza per produrre una miscela di celle a ECM in un rapporto due a uno. Mescolare bene pipettando e mescolando e conservare la miscela sul ghiaccio.
Utilizzare una pipetta microcapillare per assumere da tre a 10 microlitri di cellule. Inserire con cura la punta della pipetta in un ago di microiniezione precedentemente preparato, quindi espellere la miscela di matrice B16-F1 all'estremità dell'ago. Inserire l'ago nel supporto dell'ago e inclinarlo con un angolo di 45 gradi sul piatto.
Utilizzare una pinzetta per rompere la punta dell'ago per creare un foro abbastanza grande da far espulse le cellule dall'ago senza spremere le cellule. Accendere il cilindro dell'aria pressurizzata collegato all'apparato di iniezione, quindi ruotare momentaneamente l'iniettore in modalità continua per non più di un secondo per spingere le cellule sulla punta dell'ago. Puntare l'ago verso il sacco tuorlo di un embrione e spingerlo attraverso il sacco vitellino in direzione ventrale fino a quando la punta dell'ago non è emersa dal sacco del tuorlo e sta spingendo l'epidermide embrionale sul lato ventrale dell'embrione, appena posteriore al cuore.
Spingere con attenzione e leggermente la punta dell'ago in avanti fino a creare un piccolo spazio tra l'epidermide e la membrana sac del tuorlo. Pulsare l'iniettore per espellere parte della miscela cellulare in questo spazio perivitellino. Esaminare attentamente le dimensioni, la forma e la posizione dello xenoinnesto durante l'impianto e regolare il numero di impulsi e la posizione dell'ago di conseguenza per garantire uno xenoinnesto impiantato correttamente.
Ripetere gli impulsi fino a quando 500-800 cellule sono state iniettate nello spazio perivitellino, creando un rigonfiamento visibile che si estende almeno la metà della strada lungo il fondo del sacco del tuorlo. Rimuovere l'ago dall'embrione. Dopo aver iniettato tutti gli embrioni, utilizzare una punta di pipetta microcapillare per spingere tutti gli embrioni insieme in modo che possano essere pipettati con il meno metilcellulosa possibile.
Trasferire gli embrioni in un piatto di recupero contenente E3 con PTU e blu di metilene. Quindi pipettare delicatamente E3 intorno agli embrioni per lavarli, quindi incubare a 34 gradi Celsius. Quindi immagini embrioni anestetizzati usando un microscopio confocale.
Utilizzare un canale laser appropriato per le cellule tumorali per determinare un volume da imaged, consentendo almeno una o due sezioni ottiche su entrambi i lati dell'innesto. Utilizzare intervalli di sezione distanti circa cinque micrometri per creare una pila Z. Usa l'imaging a due canali per immaginare sia i vasi sanguigni che lo xenograft tumorale.
Immagine dello xenograft tumorale e dei vasi sanguigni per una larva e ripetere questi passaggi per ogni larva da imageare. Per iniziare con la quantificazione della risposta angiogenica allo xenograft zebrafish, trasferire i file di immagine confocali Z stack precedentemente creati di uno xenograft tumorale in una nuova cartella sul software di analisi delle immagini 3D. Per creare il protocollo Tumor Volume per la misurazione del volume dello xenograft tumorale, passare alla scheda Misurazione del menu superiore della finestra, quindi dall'elenco dei protocolli che appare trascinare il protocollo denominato Trova oggetti nello spazio intitolato Trascina attività qui per effettuare misurazioni.
Dopo aver assicurato che questo protocollo sia impostato per misurare gli oggetti nel canale tumorale, trascinare i protocolli denominati Clip to ROI e Make ROI From Population dall'elenco dei protocolli allo spazio Trascina attività qui per effettuare misurazioni, assicurandosi che questi due comandi si applichino agli oggetti identificati da Trova oggetti. Prima di calibrare le impostazioni di questo protocollo, passare al menu a discesa sopra l'etichetta Modalità in alto a sinistra della finestra e selezionare la visualizzazione Messa a fuoco estesa. Deselezionare i canali non tumorali nel riquadro all'estrema destra facendo clic sul cerchio nero sotto ogni canale in modo che sia possibile visualizzare solo il canale tumorale.
Quindi usa lo strumento Mano libera nella parte superiore della finestra per disegnare una regione di interesse, o ROI, intorno a tutto il volume tumorale. Nel pannello sotto l'immagine, selezionate l'etichetta Riepilogo e quindi impostate l'opzione Visualizza per visualizzare la popolazione due. Per calibrare, nell'attività Trova oggetti fare clic sull'asterisco per aprire la finestra delle impostazioni.
Regolare la soglia utilizzando l'intensità e determinare la soglia inferiore fino a quando non vengono selezionate solo le cellule tumorali e non la fluorescenza di fondo. Determinare la dimensione minima dell'oggetto in modo che solo le celle intatte siano misurate, al contrario di elementi più piccoli di detriti cellulari, impostando la dimensione minima dell'oggetto come 100 micrometri cubi. Salvare questo protocollo come volume tumorale facendo clic sulla scheda Misure del menu in alto e scegliendo Salva protocollo.
Utilizzare le stesse impostazioni per misurare tutti gli xenoinnesti. Per misurare il volume dei vasi sanguigni associati allo xenograft, creare un nuovo protocollo andando al menu in alto e quindi facendo clic sulla scheda Misure e quindi su Cancella protocollo. Trascinare le attività Trova oggetti e Clip in ROM nello spazio intitolato Trascina attività qui per effettuare misurazioni per questo protocollo.
Assicurarsi che il primo comando sia impostato per misurare gli oggetti nel canale del vaso sanguigno e che il comando seguente sia impostato per l'applicazione agli oggetti identificati dal primo comando. Quindi deselezionare i canali non vasi nel riquadro di estrema destra in modo che solo i vasi sanguigni possano essere visti. Determinare le impostazioni per il protocollo Vessel Volume in modo simile a quello del protocollo Tumor Volume descritto in precedenza e salvare questo protocollo come Vessel Volume.
Cancella il protocollo e disegna un ROI intorno allo xenograft, facendo attenzione a non includere alcuna autofluorescenza non tumorale. Per misurare la somma del volume degli oggetti nel canale tumorale all'interno di questo ROI, fare clic sulla scheda Misure, selezionare il comando Ripristina protocollo, scegliere il protocollo Volume tumorale e fare clic su Ripristina. Utilizzando il nuovo ROI prodotto dal protocollo Tumor Volume, fare clic sulla scheda Misure e selezionare il comando Ripristina protocollo, scegliere il protocollo Vessel Volume e fare clic sulla riga di somma per calcolare il volume totale di oggetti nel canale del contenitore all'interno di questo ROI.
Dividere il volume del vaso per il volume tumorale e moltiplicare la risposta per 100 per ottenere un valore percentuale di vascolarizzazione dell'innesto. Imaging di un singolo xenograft a sei, 24 e 48 ore dopo l'impianto, è possibile calcolare la risposta angiogenica in diversi punti di tempo, con la più grande risposta angiogenica tra le 24 e le 48 ore successive all'impianto e i livelli massimi di vascolarizzazione dell'innesto visti intorno alle 48 ore. L'imaging confocale time-lapse di uno xenoinnesto B16-F1 impiantato in un embrione zebrafish post-fecondazione di due giorni mostra vasi sanguigni etichettati GFP che crescono attraverso lo xenografto, formando una rete di torsione con vasi di dimensioni irregolari e morfologia tipici della rete vascolare anomala osservata nei tumori dei mammiferi.
Gli xenoinnesti incubati nell'inibitore del VEGFR mostrano una grande riduzione dei vasi rispetto agli xenoinnesti di controllo incubati in DMSO. Negli embrioni di controllo, c'era una vasta rete vascolare che si estendeva su tutta la regione dello xenografto, la tipica risposta angiogenica osservata dopo l'impianto di cellule B16-F1. Se quantificata, la risposta angiogenica mostra una chiara riduzione della vascolarizzazione dell'innesto negli xenoinnesti trattati con inibitore VEGFR rispetto ai controlli.
Il canale tumorale mostra una massa di cellule B16-F1 etichettate fluorescentmente sotto il sacco del tuorlo, che mostra autofluorescenza. Pertanto, un ROI deve essere accuratamente disegnato intorno allo xenograft, facendo attenzione a non includere alcuna autofluorescenza dal sacco tuorlo. Il protocollo Tumor Volume ha identificato tutte le cellule B16-F1 nel ROI, ha misurato il loro volume e ha tagliato il ROI al loro volume.
Tumor Vessel Volume Protocol in questo nuovo ROI ritagliato ha permesso l'identificazione di tutti i vasi associati alla massa delle cellule B16-F1 e ha misurato il loro volume. I valori dei protocolli Volume tumorale e Volume vaso tumorale possono essere utilizzati per dare una misura della vascolarizzazione dell'innesto. La trattabilità genetica e la permeabilità del pesce zebra consentono di investigare le vie di segnalazione elevate nell'angiogenesi tumorale e possono anche fungere da piattaforma di screening per identificare composti anti-angiogenici.
