Screening di piccole molecole e test di tossicità nelle larve di zebrafish in fase iniziale

Per iniziare, raccogli gli embrioni di zebrafish in fase iniziale tre giorni dopo la fecondazione in una capsula di Petri. Con una micropipetta da 1000 microlitri impostata su un volume di 100 microlitri, trasferire un embrione schiuso dall'aspetto sano in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. A questo punto, pipettare la quantità necessaria della sostanza chimica in esame in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.

Quindi, regolare il volume totale a 2,4 millilitri con E3 medium. Preparare il controllo del veicolo in base al solvente utilizzato per sciogliere la sostanza chimica di prova di serie. Con una pipetta da 200 microlitri, rimuovere l'eventuale soluzione E3 esistente da ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti.

Utilizzare una micropipetta a otto canali per sostituirla con 100 microlitri del terreno di prova preparato per ogni concentrazione. Assicurarsi che vengano testate un totale di 24 larve per concentrazione. Dopo 24 ore, utilizzare uno stereomicroscopio ottico per eseguire il punteggio morfologico.

Segnare la morfologia utilizzando un metodo binario, dove assente indica una morfologia normale e presente indica un'anomalia morfologica. Al termine del punteggio, rimuovere 50 microlitri di terreno da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 50 microlitri di terreno di prova appena preparato.

Rimuovere e registrare eventuali larve morte, quindi incubare le larve a 28,5 gradi Celsius con un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore. Il pesce zebra a cinque giorni dalla fecondazione ha mostrato fenotipi diversi dopo due giorni di esposizione al farmaco. I pesci zebra non affetti sono stati osservati come normali, mentre in alcuni pesci era evidente un lieve edema pericardico.

In altri è stato osservato un grave edema pericardico, accompagnato da emorragia del tuorlo ed estensione del tuorlo. È stato osservato anche uno sviluppo ritardato con riduzione della pigmentazione, della vescica natatoria e della lunghezza totale. Altri fenotipi includevano il pesce zebra con tuorlo gonfio e pinna caudale attorcigliata, pinna caudale assente e notocorda ricurva.

I casi gravi presentavano troncamento e morte con necrosi.