Gli autori ringraziano Angela Busta per l&#39;assistenza con zebrafish allevamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (AG-020.591 a SVB e 1K08AR054835 a JJD).

Nota: tutte le procedure che coinvolgono zebrafish devono essere eseguite in conformità con le linee guida, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Tutte le procedure di uso di animali illustrati in questo articolo sono stati approvati dalla University of Michigan Comitato per l&#39;uso e la custodia degli animali (UCUCA). 1. Fai Loops Sutura <ol><li> Usare pinze per separare sutura non sterili (USP 10/0 monofilo di nylon, 3 strati) in tre filoni. </li><li> Inizia a legare un doppio nodo alla marinara in uno dei filoni. Fermare prima di serrare il nodo completamente per fare un piccolo (~ 1 mm) anello anziché un nodo. </li><li> Usare le forbici per tagliare l&#39;eccesso di sutura dalle code di loop. Un esempio di un ciclo finito è mostrato in Figura 1. </li><li> Posizionare il passante sul lato adesivo di un post-it per un uso successivo. I loop suture verranno utilizzati per tenere le larve in posizione durante test forza. </li><li> Ripetere i passaggi 1,1-1,4 se necessario. Makposta due anelli di sutura per ogni larva che saranno testati. </li></ol> 2. Fai la verifica della soluzione <ol><li> Fai la soluzione Tyrodes con l&#39;aggiunta di 7,977 g di cloruro di sodio, 0,373 g di cloruro di potassio, 0,265 g di cloruro di calcio diidrato, 0,102 g di magnesio cloruro esaidrato, 0,048 g di sodio fosfato monobasico, 1.000 g di bicarbonato di sodio, e 0,037 g etilendiaminotetracetico acido disodico diidrato sale a 1.000 ml di acqua purificata. </li><li> Agitare la soluzione fino a quando i sali sono completamente sciolti. Questa soluzione può essere conservata per un mese a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 2,1 ml di 4 mg / ml tricaine, preparato secondo la Zebrafish Libro 24, a 47,9 ml di soluzione Tyrodes e mescolare. Proteggere la soluzione dalla luce depositandolo in una bottiglia di vetro scuro o in una bottiglia di vetro coperto con un foglio di alluminio. Questa soluzione deve essere conservato a temperatura ambiente e fatto fresco ogni giorno. </li></ol> 3. Tie Larva Aanesthetized in camera sperimentale <ol> &lt;li&gt; Sistemare l&#39;apparecchio di prova (figura 2) sul palcoscenico di un microscopio stereo. </li><li> Collegare il trasduttore di forza e cavi regolatore di lunghezza per l&#39;apparato di test. Accendere il trasduttore di forza. Accendere il regolatore di lunghezza in modo che rimanga rigido. (Nota:.. Controllore lunghezza fornisce la possibilità di allungare o accorciare una preparazione muscolare durante una contrazione Tuttavia, questa caratteristica del regolatore lunghezza non viene utilizzato nel metodo qui descritto Pertanto, il controllore lunghezza può essere pensato come un attacco rigido punto montato ad un sistema di posizionamento XYZ). </li><li> Con una pipetta di trasferimento monouso, riempire la camera sperimentale con la soluzione di test. </li><li> Usare pinze per prendere un anello di sutura da una delle code e appenderlo sul tubo trasduttore di forza. Appendere un secondo cappio di sutura sul tubo che collega il regolatore lunghezza. (Nota: afferrare un anello di sutura sulla parte curva può piegare la sutura e CauSE la rottura durante le fasi successive). </li><li> Con una pipetta di trasferimento monouso, trasferire una larva di zebrafish per una piccola scatola di Petri riempite con soluzione di test. Attendere che l&#39;anestetico nella soluzione di prova (tricaine) per entrare in vigore (~ 1 min). Con una pinza, spingere delicatamente la coda e verificare che la larva è anestetizzato da una mancanza di tatto evocato nuoto. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro per trasferire la larva alla camera sperimentale. </li><li> Dalla spingendo delicatamente la larva con pinza chiusa, guidare la porzione anteriore della larva attraverso l&#39;anello di sutura sul tubo trasduttore di forza. Guidare la porzione anteriore della larva attraverso l&#39;anello di sutura sul tubo. Afferrare entrambi code anello di sutura con una pinza e tirare contemporaneamente per stringere l&#39;anello di sutura posteriore al sacco vitellino o di vescica natatoria (Figura 3A). </li><li> Con una pinza, premuto uno coda anello di sutura e tirare, causando la larva di ruotare di 90 ° attorno al tubo finché il lato laterale della faccia larvas up (Figura 3B). Se il ciclo è stato tirato a sufficienza, ci sarà una certa resistenza alla trazione, la larva non dovrebbe ruotare facilmente. Se il ciclo è stato serrato troppo, la larva non ruotare attorno al tubo. </li><li> Utilizzando il dispositivo di posizionamento XYZ collegato al controller lunghezza, spostare il tubo regolatore lunghezza lungo l&#39;asse X (asse definizioni in Figura 2A) e sotto il tronco e la coda della larva. Lasciare spazio tra le estremità del tubo regolatore lunghezza e il tubo trasduttore di forza. </li><li> Guidare il loop sutura sopra la coda della larva e stringere il cappio di sutura come precedentemente descritto (Figura 3C). Potrebbe essere necessario ruotare la parte posteriore della larva in modo che la parte laterale verso l&#39;alto. Tagliare le code anello di sutura (Figura 3D). </li></ol> 4. Posizione Larva in camera sperimentale <ol><li> Spostare la larva di una distanza adeguata dal fondo della camera per garantire la larva will essere all&#39;interno &quot;distanza di lavoro&quot; di un obiettivo microscopio rovesciato durante le fasi successive. Per fare questo, utilizzare i dispositivi di posizionamento XYZ per abbassare lentamente i tubi (con larva allegata) lungo l&#39;asse Z finché i tubi tocchino appena il fondo della camera. Poi sollevare i tubi finché la larva è una distanza appropriata dalla parte inferiore della camera (~ 100 micron). </li><li> Utilizzando il dispositivo di posizionamento XYZ collegato al controller lunghezza, regolare il tubo regolatore lunghezza lungo l&#39;asse Y per allineare l&#39;asse lungo della larva con l&#39;asse longitudinale del tubo trasduttore di forza. </li></ol> 5. Forza Record Durante una contrazione contrazione massima <ol><li> Spostare il dispositivo di prova per la fase di un microscopio invertito. </li><li> Regolare la temperatura della camera di un valore desiderato. Per iniziare, collegare la vasca circolatore acqua, termometro, e regolatore di temperatura all&#39;apparecchio di prova. Accendere i componenti necessari e regolare l&#39;impostazione del contr temperaturaoller finché il termometro riporta il valore desiderato. I dati contenuti in questo articolo sono stati raccolti a 25 ° C, ma le misure possono essere effettuate anche a temperatura ambiente oppure a 28.5 ° C. </li><li> Collegare i cavi dal stimolatore per l&#39;apparato di test. Attivare l&#39;alimentazione per lo stimolatore, ma non stimolano la larva fino alla fase 5.6. </li><li> Assicurarsi che la larva è parallela al fondo della camera. Attraverso un obiettivo 40X, visualizzare la porzione di larva tra le estremità dei tubi. Se parallelamente al fondo, entrambe le estremità della larva saranno a fuoco. Se necessario, regolare il tubo trasduttore di forza lungo l&#39;asse Z fino a quando entrambe le estremità sono a fuoco. </li><li> Verificare che la lunghezza della larva è inferiore ottimale. Accendere il sistema lunghezza sarcomero video e ruotare la videocamera tale che le striature sono paralleli ai lati del fotogramma video. Questo sistema controlla spaziatura striation analizzando le variazioni di intensità dei pixel lungo ciascuna fila orizzontale di pixel all&#39;interno di una regione definita dall&#39;utente di interesse(ROI). I risultati per tutte le righe all&#39;interno del ROI vengono mediati e riportati con una frequenza equivalente al video frame-rate (≥ 80 sec-1). La spaziatura striation è utilizzato come indicatore di lunghezza sarcomero. </li><li> Regolare il microscopio a concentrarsi sulle fibre periferiche e notare la lunghezza del sarcomero indicato. Se necessario, utilizzare il dispositivo di posizionamento XYZ collegato al controller di lunghezza per regolare la lunghezza della larva (asse X) fino a quando la lunghezza del sarcomero è ottimale (es. 1.90 micron). </li><li> Regolare la corrente per ottimizzare la forza di contrazione stimolazione. Per iniziare, impostare la corrente sul stimolatore ad una grandezza bassa (ad esempio 100 mA). Lo stimolatore può essere attivato manualmente o da un computer che esegue un programma LabVIEW personalizzato. Suscitare una contrazione dei muscoli larvali con un impulso di corrente di 0.2 msec di durata. </li><li> Utilizzare un oscilloscopio per registrare l&#39;uscita forza e misurare la forza di contrazione di picco utilizzando i cursori dell&#39;oscilloscopio. Aumentare la correntecon incrementi di 50 mA e misurare la forza di contrazione di picco per ogni livello attuale. Attendere 30 secondi tra strappi per evitare l&#39;affaticamento. Con l&#39;aumentare della corrente di stimolazione, forza di contrazione di picco aumenta tipicamente ad un massimo e poi diminuisce gradualmente. La corrente a cui la larva genera la forza più grande è la corrente di stimolazione ottimali. Impostare l&#39;ampiezza della corrente per la corrente di stimolazione ottimali. </li><li> Utilizzando il dispositivo di posizionamento XYZ, regolare la lunghezza della larva (e quindi, lunghezza sarcomero) in modo da ottenere la massima forza di contrazione. Wild-type larve di pesce zebra (3-7 dpf) generare la massima forza di strappo a lunghezze sarcomero di 2,10 micron e 2.15 micron. Tuttavia, la lunghezza sarcomero può essere impostato a 2.08 micron per evitare un eccessivo sovraccarico sulla larva. </li><li> Suscitare una contrazione dei muscoli larvali. Utilizzare l&#39;oscilloscopio per registrare la risposta di forza e di salvare il record per successive analisi. </li></ol> 6. Misurare muscolatura Dimensioni con Larva a Optimal Length <ol&gt; <li> Spostare il dispositivo di prova di nuovo al microscopio stereo. </li><li> Usando la scala oculare, misurare l&#39;altezza della muscolatura, come visto dal lato. Poi, facendo attenzione a non modificare la lunghezza della larva, girevole la larva di 90 ° utilizzando le code anello di sutura al fine di visualizzare la larva dal basso. Misurare la larghezza della muscolatura come visto dal basso. Prendere le misure secondo un punto di riferimento anatomico (ad esempio apertura urogenitale) (Figura 4). </li><li> Tagliare gli anelli di sutura con una MicroBlade per rilasciare la larva dalle apparecchiature di prova. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo metodo misura la generazione di forza nel corso di una contrazione per valutare la funzione muscolare nei muscoli del tronco di larve di zebrafish. Sebbene contrazione tetanica possono essere elicitati larve zebrafish (ad esempio 200 impulsi di stimolazione / sec per una durata di 0,2 sec), la massima forza tetanica è solo del 10-15% maggiore della forza massima contrazione. Pertanto, la forza generata durante un tic è una misura ragionevole di producibilità forza. Twitches sono da preferire rispetto contrazioni tetaniche perché contrazioni sono meno probabilità di provocare lo strappo e lo scivolamento ai legami di sutura. Al fine di generare dati significativi con questa tecnica, forza massima contrazione dovrebbe essere raggiunto per ciascuna larva e la variabilità tra gruppi sperimentali dovrebbe essere minimizzato. Con questi obiettivi in ​​mente, offriamo i seguenti suggerimenti. In primo luogo, fare attenzione a quando la vendita abbinata la larva per il trasduttore di forza ed i tubi del regolatore di lunghezza. Se gli anelli di sutura vengono serrate troppomolto, la sutura taglierà il tessuto muscolare. Se i loop sutura non sono strette abbastanza, la forza generata dalla larva non sarà pienamente trasmesso al trasduttore di forza. Entrambe le situazioni, ma soprattutto quest&#39;ultimo, sottovalutano la massima forza di contrazione. In secondo luogo, dal momento che test più gruppi sperimentali può richiedere diverse ore (20-30 min / larva), si alternano tra i gruppi, perché le larve continuerà a sviluppare durante il periodo di prova. Mentre una parte del materiale citato è essenziale per la misura della massima forza di contrazione (ad esempio trasduttore di forza, stimolatore di corrente), le altre voci non sono assolutamente necessari. Il sistema lunghezza sarcomero video è auspicabile ma non obbligatorio. Come alternativa, una serie di contrazioni può essere utilizzato per trovare lunghezza ottimale, durante la quale la lunghezza della larva viene regolata fino forza massima contrazione è raggiunto. Una regolazione della temperatura non è assolutamente necessario. Il controllo della temperatura è fondamentale quando meaSuring cinetica a contrazione, che sono molto sensibili alla temperatura, mentre la massima forza di strappo non è particolarmente sensibile a piccole variazioni di temperatura e potrebbe essere misurata a temperatura ambiente. Si noti che, indipendentemente dalla temperatura nella camera durante la prova forza, le larve dovrebbe essere mantenuta alla temperatura di crescita ottimale di 28,5 ° C 24 prima costringere test per la stadiazione accurata. Le larve sono testati in una soluzione contenente Tyrodes tricaine. Usiamo 0,02% (w / v) tricaine, la concentrazione raccomandata per l&#39;anestesia 24, per eliminare contrazioni spontanee evocati dal sistema nervoso e quindi prevenire l&#39;affaticamento durante il test forza. Tricaine facilita anche il tie-in step e riduce il tempo di prova generale. Tuttavia, si osserva che anche tricaine nella soluzione di test costantemente riduce la forza massima di contrazione di circa il 30%. Un effetto simile è stato osservato anche in girino muscolo coda, dove tricaine ridotta generazione di forza dopo la trasmissione neuromuscolare è stata bloccata, il che suggerisce che tricaine ha un effetto diretto sul muscolo 25. Tricaine può ridurre l&#39;eccitabilità delle cellule muscolari riducendo conduttanza sodio attraverso la membrana cellulare, come avviene nelle cellule nervose 26. Altre opzioni per il blocco di attivazione di motoneuroni sono d-tubocurarina e α-bungarotossina ma, a differenza di tricaine, questi composti non sono pelle-permeabili e devono essere iniettati direttamente nella testa, il midollo spinale, o di cuore 27. Investigatori individuali dovranno valutare se tricaine è auspicabile per l&#39;applicazione specifica. Se tricaine è inclusa nella soluzione di prova, la concentrazione dovrebbe essere coerente tra esperimenti e ricercatori devono verificare che l&#39;effetto del tricaine non varia tra i gruppi sperimentali. Descriviamo questo metodo per le larve di appena 3 dpf e vecchio come 7 dpf. Sebbene le fibre muscolari appaiono functional già 17 ore dopo la fecondazione, quando i movimenti spontanei di coda iniziano 27, la ridotta lunghezza della coda prima di 3 dpf ostacola legando la larva per le apparecchiature di prova. Noi di solito non testiamo larva dopo 7 dpf da molti modelli di malattia non sopravvivono molto più a lungo questo momento. Se testare larve oltre 5 dpf, le larve dovrebbe essere alimentato. Abbiamo osservato che le larve a digiuno hanno muscoli più piccoli e generare meno forza massima di contrazione rispetto nutrito larve, probabilmente a causa della diminuzione sacco vitellino. Così può essere desiderabile per testare larve tra 3-5 dpf, per evitare la variabile aggiuntiva di alimentazione esterna. In sintesi, si descrive un metodo quantitativo e affidabile per misurare la generazione di forza nel corso di una contrazione contrazione massima dei muscoli del tronco zebrafish larvale. Questo metodo può essere utilizzato per valutare la salute generale del muscolo larvale zebrafish e specificamente fornisce informazioni sulla funzione muscolare. Oltre a fornire informazioni sullagrandezza della generazione della forza, questa tecnica può essere usata per studiare la cinetica di generazione di forza o essere adattato per studiare l&#39;affaticamento muscolare 22. Sebbene si descrive questa tecnica per l&#39;utilizzo con wild-type larve, questo metodo può essere utilizzato per larve geneticamente modificata o per larve trattate con farmaci o sostanze tossiche, per caratterizzare modelli di malattie muscolari e valutare i trattamenti, o per studiare sviluppo muscolare, lesioni muscolari, o correlata muscolo tossicità chimica.

Giovane pesce zebra (Danio rerio) larve, 3-7 giorni dopo la fecondazione (DPF), sono sempre più riconosciuto come un organismo utile per la ricerca del muscolo scheletrico. Giovani larve sono utilizzati per modello di malattia muscolare umana 1-9, valutare i farmaci e strategie terapeutiche 10-11, lesioni muscolo studio 12, comprendere lo sviluppo muscolare 13-16, e indagare muscolare correlata tossicità chimica 17-19. Studi tipiche in queste aree esaminare il grado in cui muscolo sano è resa anomala da manipolazione genetica o l&#39;esposizione a sostanze tossiche, e alcuni studi esaminare il grado in cui muscolare anormale risponde al trattamento. Fondamentale per il successo di questi studi è la capacità di valutare con precisione la salute dei muscoli. Mentre ci sono una varietà di metodi disponibili per valutare la salute del muscolo in larve di pesce zebra, alcuni forniscono informazioni dirette sulla funzione muscolare. La salute dei muscoli è di solito valutata appearance, come valutato mediante colorazione istologica 6,8,11, immunoistochimica 9,15,16,18, microscopia ottica 3,13, microscopia elettronica 3,4,14,16 o birifrangenza 7,9,11, ma queste tecniche forniscono informazioni morfologiche solo. Tronco e spostamenti di coda e il nuoto di velocità 4,17 valutare la funzione motoria, ma queste non sono misure dirette della funzione muscolare in quanto riflettono anche l&#39;input neurale, il metabolismo energetico, e di altri processi. In contrasto, misurando generazione della forza durante la contrazione fornisce una valutazione diretta della funzione muscolare e rappresenta una misura di salute muscolare generale. Aggiunto vantaggi di questo approccio includono l&#39;analisi dei dati semplice e risultati quantitativi. In questo articolo video, mettiamo a disposizione una procedura dettagliata per la misurazione della generazione di forza dai muscoli larvali, nella speranza che altri ricercatori useranno questo metodo per integrare le misure esistenti di salute dei muscoli nella loro ricerca. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di misurare la generazione di forza durante la contrazione dei muscoli del tronco zebrafish larvale. Per raggiungere questo obiettivo, una larva zebrafish è anestetizzato e posto in una camera riempita con una soluzione salina. L&#39;estremità anteriore della larva è legato a un trasduttore di forza e l&#39;estremità posteriore della larva è legato a un regolatore di lunghezza. Attivazione muscolare è compiuta stimolazione del campo elettrico, e la corrente di stimolazione e la lunghezza della larva vengono regolate per produrre forza massima contrazione. Una contrazione contrazione isometrica è suscitato e la risposta forza viene registrata per l&#39;analisi. Per essere chiari, questa tecnica non misura le forze generate dai muscoli larvali durante il nuoto. Poiché entrambe le estremità della larva sono legate al materiale e poiché la larva rimane anestetizzato, non può avviare il movimento durante la prova. Inoltre, stimolazione del campo attiva tutte le fibre muscolari nello stesso tempo per indurre un bilcontrazione ateral, che non è quello che naturalmente si verifica 20. Pertanto, invece di misurare forze effettive generate durante il nuoto, questa tecnica determina la producibilità forza dei muscoli larvali. Abbiamo utilizzato questa tecnica per dimostrare debolezza muscolare in un modello di zebrafish nemaline miopatia 21, nonché per valutare l&#39;effetto del trattamento antiossidante sulla funzione muscolare in un modello di zebrafish malattia multi-minicore 22. Altri hanno usato una tecnica simile 23 per esaminare gli effetti di un inquinante ambientale sulla funzione muscolare 19.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

Larve di zebrafish fornire modelli di sviluppo muscolare, malattie muscolari e correlata muscolare tossicità chimica, ma gli studi relativi spesso mancano di misure funzionali di salute dei muscoli. In questo articolo il video, si dimostra un metodo per misurare la generazione di forza durante la contrazione dei muscoli del tronco zebrafish larvale. Misure di forza sono realizzate ponendo una larva anestetizzato in una camera riempita con una soluzione salina. L&#39;estremità anteriore della larva è legato a un trasduttore di forza e l&#39;estremità posteriore della larva è legato a un regolatore di lunghezza. Una contrazione contrazione isometrica è sollecitata da stimolazione del campo elettrico e la forza di reazione viene registrata per l&#39;analisi. Generazione di forza durante la contrazione fornisce una misura della salute muscolare generale e specifico fornisce una misura della funzione muscolare. Sebbene si descrive questa tecnica per l&#39;utilizzo con wild-type larve, questo metodo può essere utilizzato con larve geneticamente modificati o da larve trattate con farmaci o sostanze tossiche,per caratterizzare modelli di malattia del muscolo e valutare i trattamenti, o per studiare lo sviluppo muscolare, lesioni o tossicità chimica.

Nel sano selvaggio tipo zebrafish larve, le fibre muscolari dovrebbero essere parallele tra loro senza grandi spazi vuoti tra loro e hanno evidenti striature (Figura 5A). Wild-type larve di zebrafish che non presentano queste caratteristiche, o con danni evidenti come le fibre staccate (Figura 5B), deve essere eliminata. Un grafico rappresentativo di forza contro twitch picco di corrente per una larva zebrafish stimolazione è mostrato in Figura 6. Per wild-type larve di zebrafish tra 3-7 dpf, la corrente di stimolazione ottimali è in genere tra 400-600 mA, con 3 dpf larve generalmente richiedono corrente di 6-7 dpf larve maggiore stimolazione. I dati grezzi di forza (raccolti durante la fase 5.8) deve essere elaborati e analizzati con il software di analisi dei dati. Prima, la linea di base del record forza viene impostato a zero. Secondo, la tensione di uscita del trasduttore di forza è convertita alla forza (mN) (vedi istruzioni del produttore per generare una curva di calibrazione per il trasduttore di forza). Una risposta forza rappresentante raccolte durante una contrazione contrazione massima di una singola larva è mostrato in Figura 7. Software di analisi dati può essere utilizzato per misurare la forza di picco e altre caratteristiche della risposta di forza. Una serie di dati rappresentativi forza di picco di contrazione contrazioni massimali è mostrato in Figura 8A. Contrazione di picco valori di forza tipici di wild-type 3-7 dpf gamma larve di 0,9-1,7 milioni di euro, con larve più vecchio generare più forza del più giovane larve. Differente sforzo contrazione di picco può essere dovuto a normali processi come la crescita e lo sviluppo (Figura 8) o processi anomale quali gene mutazione patologie legate 21,22. Normalizzazione dopo muscolo area di sezione trasversale (CSA) può essere utilizzato per determinare il grado in cui le differenze vigenti contrazione di picco sono semplicemente a causa differe<html> nces nella dimensione della muscolatura 21,22. CSA muscolare può essere stimata utilizzando la formula: CSA = π (A / 2) (B / 2), dove A è l&#39;altezza della muscolatura, come visto dal lato, B è la larghezza della muscolatura come visto dal basso, e una sezione trasversale ellittica è assunto. Valori tipici per CSA wild-type 3-7 dpf gamma larve 0,027-0,034 mm 2, con 3-4 dpf larve generalmente mostrando valori CSA inferiori a 5-7 dpf larve. Un insieme rappresentativo di dati normalizzati forza di picco di contrazione contrazioni massimali è mostrato in Figura 8B. Contrazione di picco valori normalizzati tipici forza per wild-type 3-7 dpf gamma larve 34-51 mN / mm 2, con 4-7 dpf larve generalmente mostrando valori superiori a 3 dpf larve. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> Figura 1. Anello di sutura. Frecce indicano le code anello di sutura. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> Figura 2. (A) apparato di prova con i componenti etichettati. (B) Primo piano vista della camera sperimentale. (A) camera sperimentale con fondo trasparente. (B) trasduttore di forza. (C), regolatore di lunghezza. (D) dispositivi di posizionamento XYZ. La X, Y e Z sono definiti in alto a destra. (E) sistema di controllo della temperatura che utilizza moduli termoelettrici. Tubi accomoda flusso d&#39;acqua per il raffreddamento dei moduli termoelettrici. (F) Tubo di acciaio inox collegato al trasduttore di forza. (G) in tubo di acciaio inox collegato al regolatore di lunghezza. (H) Termometro microsonda. (I) di platino paralleli elettrodi a piastra, che coprono la lunghezza del glida camera. Piastre di platino sono il 2,5 mm di altezza e di spessore 0,255 millimetri. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> Figura 3. Tying larva in camera sperimentale. (A) Larva legato a alla estremità anteriore, ma non ancora ruotato di 90 °. (B) Larva dopo aver ruotato di 90 °. (C) Larva legata su alla fine posteriore, ma non ancora ruotato. (D) Larva dopo code anello ribaltati e sutura vengono eliminati. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> Figura 4. Misure per l&#39;area della sezione trasversale di stima. Muscolatura quando visto da (A) lato e (B) </strong&gt; fondo. Posizionamento delle barre rosse indicano la posizione di apertura urogenitale. La lunghezza delle barre rosse indicano l&#39;altezza e la larghezza della muscolatura come visto dal lato inferiore e rispettivamente. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> Figura 5. Vista laterale di zebrafish muscolatura del tronco larve. (A) del tessuto sano. (B) Tessuto con danni evidenti. Contratture derivanti da distacchi di fibra sono contrassegnati con un asterisco. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> Figura 6. Trama Rappresentante della forza contrazione di picco contro corrente di stimolazione. La corrente di stimolazione ottimale è di 500 mA. Figura 7. Record di forza di riferimento per una singola contrazione contrazione. Tale contrazione è stata evidenziata con un impulso di stimolo a 0 msec. La forza di picco è 1,56 milioni di euro. <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> Figura 8. Dati di forza di riferimento 3-7 dpf larve. (A) di picco dati della forza di contrazione contrazioni massimali. (B) i dati di picco della forza di contrazione contrazione massime normalizzate a CSA. Larve più vecchio (6-7 dpf) erano alimentati Hatchfry Encapsulon Grado 0 con Spirulina (Argent Laboratories) a partire dal 5 dpf. Mezzi + deviazioni standard sono segnalati con N = 5 di ogni gruppo. Gruppi significativamente diversi da 3 dpf larve (*) e 4 dpf larve (#) sono indicate (ANOVA, P &lt;0.05). Il significativo aumento della forza normalizzato compreso tra 3 e 4 dpf (B) indica un aumento della forza generatrice intrinseca capacità durante questo periodo di tempo, mentre l&#39;aumento di forza tra 4 e 6-7 dpf (A) è attribuito a crescita basata su nessuna cambiare dal 4 al 7 dpf vigente normalizzato.

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Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Misure di forza possono essere utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella funzione muscolare a causa di sviluppo, infortunio, malattia, trattamento o tossicità chimica. In questo video, dimostriamo un metodo per misurare la forza durante una contrazione massimale di zebrafish muscolare tronco larvale.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  University of Michigan. Misure di forza possono essere utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella funzione muscolare a causa di sviluppo, infortunio, malattia, trattamento o tossicità chimica. In questo video, dimostriamo un metodo per misurare la forza durante una contrazione massimale di zebrafish muscolare tronco larvale.

Video: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

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Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage di larve Zebrafish

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Valutazione della funzione muscolare del muscolo estensore lungo delle dita<em&gt; Ex vivo</em&gt; E Muscolo tibiale anteriore<em&gt; In situ</em&gt; In Mouse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...