Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (NIH) concede R01DK069403 e P30DK079307.

Parte del protocollo che segue si basa su metodi pubblicati riportato da (Hentschel et al. 2005) e (Weinstein et al. 1995) con lievi modifiche. Parte 1: Microiniezioni Impostare in anticipo per la microiniezione <ul><li> I pesci vengono iniettati a 2 giorni dopo la fecondazione (DPF). Pertanto, zebrafish adulti sono allevati 3 notti prima di un esperimento programmato. Raccogliere embrioni e porle in una piastra di Petri con acqua E3 (5mm NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm di CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4) a 28.5 ° C. Al termine della prima giornata rimuovere gli embrioni morti dalla piastra di Petri e gli embrioni separati in modo che non ci sono 80-100 embrioni per piastra di Petri. </li><li> Preparare gli aghi di vetro tirando da tubi capillari (4 cm di lunghezza, 0,63 / 0,20 OD / ID millimetri (mm) R-6 tubi di vetro personalizzati Drummond società scientifiche, Broomall, PA 9-000-3000) con un estrattore elettrodo. Il diametro punta dovrebbe essere di 10-20 micron. Sotto un microscopio da dissezione (Leica S6E), con un pennarello indelebile consumare circa 10 linee 1 millimetro lungo l&#39;ago, con l&#39;aiuto di un righello, e conservare gli aghi in un grande piatto di Petri su rampe d&#39;argilla. </li><li> Preparare la pipetta azienda: Fire-lucidare la punta di un sottile tubo di vetro borosilicato parete capillare (152 mm, 1 / 0,75 OD / mm ID TW100-6, strumenti di precisione del Mondo, Inc.) in una fiamma becco Bunsen fino al diametro interno di la punta è 0,4-0,5 mm. Tale dimensione consente una buona presa del sacco vitellino di una larva 2 dpf zebrafish. Tenere una estremità di un pezzo di vetro capillare con pinze lunghe, e il calore con la punta opposta del capillare con il becco Bunsen, posizionandolo in verticale sopra il cono di luce azzurra interna della fiamma, la parte più calda, per 1-2 secondi, rotolare per ottenere un ancora sciogliersi. Ripetere questa operazione un paio di volte quindi esaminare il capillare al microscopio, su un micrometro (Ward 94 W 9910). Questo è un passo critico, potrebbe essere necessario fuoco lucidare un pipette tenendo pochi e selezionare il formato più tardi, mentre si stanno manipolando le larve. Se si sta attenti, un&#39;azienda pipetta dura microiniezione sessioni multiple. </li><li> Riempire la pompa manuale Microsiringa (MMP, World Precision Instruments, Inc.,) con olio minerale, seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Il titolare pipetta è inserito in un manipolatore joystick (Narishige, MN-151), collegato con un supporto magnetico (Narishige, MN 151) a una piastra di ferro (Narishige, IP). </li></ul> Microiniezione <ul><li> Preparare 20μl della miscela di iniezione:. 2.4μl gentamicina (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml in soluzione salina) e 17.6μl 10-kDa lucifer giallo destrano (Invitrogen D1825, (1mg/ml in soluzione salina) Nel pesce controllare l&#39; gentamicina viene sostituito con una soluzione salina. Il destrano fluorescente (molti colori diversi possono essere usati) è sufficiente a verificare l&#39;esattezza di iniezione e selezionare le larve che sono stati iniettati con la nephrotoxicant. </li><li> Predisporre 2 30 millimetri Petri con 2 ml di olio minerale per l&#39;immissione della miscela di iniezione e la miscela sotto controllo, per prevenire l&#39;evaporazione delle soluzioni. </li><li> Preparare l&#39;anestetico: 400 mg tricaine polvere (etil-m-amminobenzoato metanosolfonato SIGMA A-5040) 97,7 ml di acqua DD, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Regolare a pH 7. Conservare questa soluzione, nel congelatore, in aliquote di 4,2 ml. Per utilizzare tricaine come anestetico diluire 4,2 ml di soluzione madre tricaine in 100 ml di acqua E3 (Westerfield 1993) e lasciare a temperatura ambiente. </li></ul> I seguenti passaggi sono svolti nell&#39;ambito di un microscopio da dissezione <ul><li> Rimuovere manualmente ogni chorions restante con una pinza sottile e anestetizzare il pesce zebra trasferendoli in piastre di Petri con tricaine riscaldato a temperatura ambiente. Zebrafish dovrebbero essere esposti a tricaine almeno 15 minuti prima di iniziare le microiniezioni. </li><li> Aprire la punta di un ago da iniezione con una lama di rasoio (VWR scientifico 55411-050). Tenere la lama con una leggera angolazione per creare una smussatura e taglio la punta tale da ottenere una apertura punta del diametro di circa 10-20μm. </li><li> Accendere, vuoto e aria dell&#39;apparato microiniezione (World di strumenti di precisione Inc., PV820 pneumatici picopump). Inserire l&#39;ago nel porta-aghi montati sulla base micromanipolatore e inclinazione (Strumenti di precisione Parola, Inc., modello M3301R, TB-1). </li><li> Per riempire l&#39;ago, inserire una goccia (10μl) della soluzione da iniettare nel piatto 30 millimetri Petri riempite con olio minerale (Chimica Fisher, 0121-1). Girare il micromanipolatore manuale in modo da far immergere la punta dell&#39;ago nella goccia di soluzione, impostare il picopump &quot;hold / vent&quot; interruttore &quot;vent&quot; (&quot;sfogo&quot; corrisponde a vuoto sul PV820), e riempire l&#39;ago tirando soluzione dalla punta dell&#39;ago. Ci vorrà qualche minuto, se la soluzione entra l&#39;ago troppo veloce,questo significa che il diametro della punta è troppo grande, e le iniezioni non sarà accurato. Dopo che l&#39;ago è riempito, impostare il picopump a &quot;hold&quot; (&quot;hold&quot; corrisponde a iniettare sul PV820). </li><li> Per calibrare l&#39;ago, impostare il picopump &quot;gated / temporizzata&quot; interruttore &quot;gated&quot;, premere il pedale per scaricare l&#39;ago, e registrare il tempo necessario (secondi) per il menisco di viaggiare da una marcatura a quello successivo (1 mm Distanza totale). Ripetere 3 volte, prendere il tempo medio (in secondi), e dividere il valore per 30 (volume in nanolitri (nl) corrispondente a 1 mm di distanza lineare) per determinare il numero di millisecondi necessari per fornire 1 nl di soluzione. Regolare la manopola del periodo di gamma a questo numero, e spostare l&#39;interruttore &quot;gated / tempo&quot; a &#39;tempo&#39;. Ora il picopump è impostato per fornire un impulso 1nl di soluzione. </li><li> Rimuovere il piatto olio minerale e posizionare la piastra di Petri con le larve al microscopio. Gruppo il pesce al centro della scatola di Petri e messa a fuoco. </li><li> Posizionare la pipetta partecipazione nella microsiringa pompa manuale (MMP, strumenti di precisione World) sul lato opposto della microinjector, anticipo la sua punta alla piastra di Petri, e nel piano di messa a fuoco del microscopio. Piega con un angolo poco profondo, in modo che la punta della pipetta holding è toccare il fondo della scatola di Petri ed è vicino a orizzontale. Assicurarsi di non avere bolle d&#39;aria nel sistema, che potrebbe rallentare i tempi di risposta e diminuire la precisione della MMP. </li><li> Cambia per un ingrandimento maggiore sul microscopio e utilizzare un ciglia superfine con maniglia (Ted Pella 113) per posizionare il pesce larvale lato dorsale verso il basso con il tuorlo molto vicino alla pipetta holding. Tenere il pesce larvale succhiando il tuorlo nella pipetta tenendo ruotando in senso antiorario l&#39;unità micrometro controllo della pompa manuale microsiringa. Fare attenzione a non trasformare il micrometro troppo lontano, come il tuorlo può scoppiare se tirato troppo in profondità nella pipetta holding. Focus sulla formazione comune vena cardinale, che si trova sopra il tuorlo, appena sotto il periderm ed è il sito del flusso di sangue molto alto. Con il micromanipolatore dell&#39;apparato iniezione, guidare l&#39;ago nella vena sviluppo comune cardinali. È in genere necessario per tirare l&#39;ago un po &#39;indietro dopo l&#39;inserimento, in quanto la vena comune cardinale è molto superficiale. Iniettare 1nl della soluzione premendo il pedale, quindi rilasciare le larve dalla pipetta holding e restituirla all&#39;acqua embrione. Questo è un passo critico, soprattutto la prima volta, perché richiede una certa pratica nel posizionamento del pesce e il controllo della pressione di aspirazione e l&#39;impianto di perforazione. Se il tuorlo di un embrione sia correttamente tenuto con la pipetta holding, non rotolerà come l&#39;ago entra. </li><li> Per verificare il successo della microiniezione, monitorare la presenza del giallo Lucifero destrano nel cuore del pesce zebra sotto un microscopio a fluorescenza. Il giallo Lucifero rimane visibile nel cuore per circa 20 minuti prima di dissiparsi nel sistema circolatorio Se la soluzione viene iniettata nefrotossici correttamente, entro 2 ore dall&#39;iniezione si vedrà ben poco lucifer giallo destrano rimanendo nel sito di iniezione. Se la soluzione viene iniettata nel sacco vitellino, un po &#39;di Lucifero giallo destrano rimarrà al sito di iniezione. (Fig. 1). Ritorna il pesce e medie E3. </li><li> Due giorni dopo l&#39;iniezione, le larve si sviluppano edema pericardico come conseguenza della ridotta funzionalità renale (Fig. 2). </li></ul> Parte 2: Fissazione e immunofluorescenza con Na + / K + ATPasi anticorpi (α-6F) <ul><li> A 4 dpf, mettere tra i 10 ei 15 zebrafish larvale in flaconcini di vetro 4ml (Weathon, 225.012) e fissarli negli anni Dent 1 ml (80% MeOH 20% DMSO) per 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Reidratare gli embrioni in un graduale MeOH / PBT (PBS con 0,5% Tween20) serie, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, pipettaggio la soluzione fuori e l&#39;aggiunta di nuova soluzione al flacone stesso (1 ml di soluzione per fiala), 20 minuti in ogni soluzione. Le larve non dovrebbe mai essere esposto all&#39;aria, lasciare una piccola soluzione che copre le larve quando si cambia soluzioni. </li><li> Rimuovere e sostituire PBT 1 ml con la soluzione bloccante (PBS con l&#39;1% di DMSO, 0,5% Tween20, 10% siero di capra normale) per 3 ore a 4 ° C su un nutator. </li><li> Trasferire le larve in una microcentrifuga 2 ml. Rimuovere il blocco siero e sostituirlo con 300μl anticorpo primario nella soluzione di incubazione (PBS con l&#39;1% di DMSO, 0,5% Tween20, 2% siero di capra normale) notte a 4 ° C su un nutator. Noi utilizziamo un anticorpo monoclonale Na + / K + ATPasi anticorpi (α-6F, surnatante, studi sullo sviluppo Ibridoma Banca, Iowa) alla diluizione 1:25 </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo primario e lavare 3 x 30 minuti con una soluzione di incubazione a temperatura ambiente. </li><li> Incubare con anticorpo secondario (capra anti-topo Cy3, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 155-165-003) diluito 1:500 in soluzione di incubazione per 2 ore aRT. </li><li> Lavare 3 x 30 minuti con PBT. </li></ul> Parte 3: embedding in plastica con JB-4 <ul><li> Disidratazione dei tessuti attraverso una serie graduata di etanolo (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minuti per passo. </li><li> Preparare la soluzione di infiltrazione: 25 ml di JB-4 Soluzione Embedding A (Polysciences 0226A) e 0.24g di catalizzatore (Polysciences 02.618). Ci vuole un po &#39;per il catalizzatore per sciogliere, circa 20-30 minuti. La soluzione può essere conservato a 4 ° C fino a 1 mese. </li><li> Decantare l&#39;etanolo al 100% e sostituirlo con una soluzione di infiltrazione di plastica. Mettere le provette a 4 ° C su una rotatori e permettere infiltrazioni di procedere fino a quando il lavandino larve sul fondo della fiala di vetro. Questo processo richiede di solito circa 30 minuti. </li><li> Incorporare protocollo: Posizionare il vassoio di plastica tazza stampaggio (Polysciences, Inc. 16643A) sotto un microscopio da dissezione. Trasferire le larve, insieme con una soluzione di infiltrazione di coprire, nelle coppe. I mezzi di inclusione viene preparato in un tubo di plastica di piccole dimensioni. Normalmente incorporare 4-5 pesce alla volta, un pesce per ogni tazza. Preparare 5-6 ml di plastica embedding (1,2 ml di soluzione di embedding per ogni tazza), aggiungendo 35 l di JB-4 Embedding Soluzione &quot;B&quot; (Polysciences Inc. 0226B) per ogni ml di soluzione di infiltrazione. Aggiungere 35 ml di JB-4 Soluzione Embedding &quot;B&quot; (Polysciences Inc. 0226B) per ogni ml di soluzione di infiltrazione. Mescolare bene, pipettando su e giù con una plastica volte pipetta Pasteur diverse. Questo è importante perché se non mescolato bene i JB-4 non si polimerizza in modo corretto. Dopo 5 ml di plastica incasso è stato preparato, rimuovere plastica infiltrazioni provenienti da tutto campioni con una pipetta Pasteur. Riempire la tazza con l&#39;incorporamento di plastica. La plastica deve fuoriuscita della coppa, per garantire una buona attaccamento del titolare blocco al modello. Per rilevare zebrafish tubuli renali, le sezioni trasversali sono i migliori. A tal fine, i pesci sono integrati verticalmente, a testa in giù. Con l&#39;aiuto di un ciglio con maniglia o una pinza sottile, periodicamente la posizione del pesce in verticale, fino a quando la plastica è abbastanza duro che non si muovono dalla loro posizione. Ci vogliono circa 20-30 minuti. Poi, luogo del titolare EBH-2 Block (Polysciences Inc. 15.899) oltre le coppe e lasciare il vassoio a 4 ° C durante la notte. Quando polimerizzazione in completo, si può saltar fuori i blocchi come cubetti di ghiaccio. </li><li> Embedding protocollo alternativo per le larve più: Riempire gli stampi a metà con completa JB-4 e permettono di polimerizzare. Per i 15 stampi mm quadrati usiamo il JB-4 volume a 700μl di riempire lo stampo a metà strada. Quindi, aggiungere le larve JB-4 imbevuto di indurente per la pre-polimerizzato riempito a metà stampi. Orientare le larve con la testa rivolta verso il lato lungo dello stampo e allineare le larve in modo che il line up occhi (si può mettere 10 pesci in un unico stampo in una linea). Dopo il blocco è polimerizzato è possibile tagliare i bordi del blocco, girarlo in modo che il lato sia rivolto il coltello e colla per una plastica &quot;Chuck&quot; che si inserisce nel microtomo. Con questo metodo è possibile posizionare un gran numero di larve nello stesso blocco, centrato nella plastica, e pronto per sezioni. Cura deve essere presa orientare il blocco al coltello in modo che le sezioni equivalente di ogni pesce vengono prese in un&#39;unica sezione. Questo può essere realizzato mentre sezionare attraverso gli occhi: cioè orientare il blocco in modo che le sezioni equivalente degli occhi sono presi per ogni pesce. Il risultato finale è che si può analizzare molti pesci in concomitanza su un vetrino da microscopio singolo. </li></ul> Parte 4: sezionamento <ul><li> Impostare il campione nel porta mandrino del microtomo (usiamo un Finesse Shandon Thermo Electro Corporation microtomo) </li><li> Impostare la diapositiva più calda a 45 ° C. </li><li> Versare acqua deionizzata in un bicchiere e posizionarlo vicino al microtomo </li><li> Prima di sezionamento, assicurarsi che il blocco è orientato in modo da ottenere perfetta sezioni trasversali del pesce. Le leve di regolazione testa di orientamento può essere ruotata consentendo quindi di posizionare la testa del campione con precisione al coltello. Iniziare a tagliare sezioni spesse attraverso la testa del pesce. Mentre sezionamento attraverso gli occhi, orientare il blocco in modo che le sezioni equivalente degli occhi sono presi per ogni pesce. Quando le pinne pettorali elencati nelle sezioni, cioè quando i tubuli pronephric inizio. Da questo punto, tagliate circa 32 4 sezioni um dal blocco. </li><li> Raccogliere le sezioni con una pinza e lasciate cadere nel bicchiere con l&#39;acqua, senza toccare l&#39;acqua con le pinze. La sezione si espanderà non appena colpisce la superficie dell&#39;acqua, ora lo si può raccogliere in una diapositiva. Inserire il vetrino in acqua ad un angolo di 45 ° e l&#39;approccio alla sezione con l&#39;aiuto di un ciglio con manico, toccando solo i confini della sezione. </li><li> Incubare i vetrini su un vetrino più caldo fino a completa asciugatura. </li><li> Sezioni di immagine usando la microscopia confocale o epifluorescente. </li></ul> Parte 5: Res RappresentanteULT Quando eseguito correttamente, il pesce iniettato apparire come in figura 1, con poco destrano fluorescente (in questo caso Lucifero giallo) visibile nel cuore e nel sistema circolatorio. Se l&#39;iniezione è troppo profonda, materiale iniettato può essere visto concentrata nel sacco vitellino, o il cuore può essere forata causando un eccessivo sanguinamento. Se la pipetta azienda è fatta correttamente, il pesce non rotolerà o spostare quando iniettato, e questo permetterà una iniezione più accurata. Inoltre, è importante assicurarsi di non avere bolle d&#39;aria nel MMP, che rallenterebbe i tempi di risposta e diminuire la precisione del sistema. In generale, come conseguenza della nefrotossicità gentamicina, l&#39;80% del pesce iniettato sviluppare edema pericardico (Fig. 2). Usiamo un sistema di classificazione basato fenotipo, in cui i pesci con edema moderato mostrano evidente edema pericardico, ma non gli altri fenotipi osservabile, mentre severamente pesce edematosa mostrano edema pericardico e tronco, con lieve a moderata curvatura asse. Utilizzando un anticorpo contro il tubulo renale Na + / K + ATPasi (α-6F) possiamo visualizzare i tubuli danneggiati nelle sezioni trasversali, con una evidente perdita di polarità delle cellule e interruzione tubolare in tubuli danneggiati rispetto ai controlli (Fig. 3). Questo fenomeno è presente attraverso molteplici sezioni trasversali. Al fine di ottenere un perfetto sezioni trasversali dei tubuli renali è importante posizionare correttamente il pesce durante la incorporamento. Quando si confrontano sezioni, pinne pettorali e tubuli contorti prossimali sono utilizzati come marcatori anatomici. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microiniezione nefrotossina. (A) iniezione di successo di un 10kDa destrano coniugato con lucifer giallo, con espressione debole nella vena comune cardinale, freccia bianca. (B) di iniezione errato, con conseguente deposito di 10kDa destrano coniugato al giallo Lucifero che non dissipa nel sistema circolatorio, freccia rossa. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gentamicina-mediata edema. (A) Controllo iniettato zebrafish larvale. Gentamicina iniettato zebrafish larvale con (B), moderata o (C), edema grave. Tutte le larve sono in 4 con dpf anteriore a sinistra e dorsale è alto. Frecce nere indicano edema pericardico in B e C. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. AKI immunoistochimica. α-6F colorazione anticorpi per Na + / K + ATPasi 48 ore post iniezione di gentamicina (4 larve DPF) nel controllo (A, B) e iniettato gentamicina (C, D) larve. A, C sono a 20X di ingrandimento e di B e D sono 3X ingrandimenti digitali dei tubuli destra in perdita Nota A e C. di polarità basolaterale e interruzione tubulo, freccia bianca, in D rispetto a B.

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia.">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li><li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock,+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish.">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1993).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo abbiamo mostrato un video di tecnica di microiniezione per via endovenosa per un modello di danno renale acuto, con la creazione di gentamicina mediato danno del tubulo prossimale nelle larve zebrafish. Questo danno provoca la formazione di pericardico e / o edema lordo, che riflette l&#39;incapacità di regolare l&#39;equilibrio idrico. Abbiamo anche descritto un esperimento immunoistochimica con un anticorpo che segna tubuli renali differenziata (Majumdar et al. 2000), mostrando la perdita di polarità cellulare e una perturbazione del tubulo prossimale nei reni danneggiati. Microiniezioni per via endovenosa rappresentano un metodo efficiente per la consegna di una sostanza solubile nel sangue delle larve di zebrafish. Questa tecnica è un ottimo strumento per l&#39;introduzione di una varietà di sostanze e con l&#39;aiuto di un iniezioni marcatore fluorescente uniforme può essere ripetuto più volte consentendo risultati coerenti.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>&alpha;6F mouse monoclonal </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental study Hbridoma Bank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Block Holder EBH-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, INC</td>
<td>TW100-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company, Broomall PA</td>
<td>9-000-3000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalyst Powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>02618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.</td>
<td>155-165-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular probes</td>
<td>D1825</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eyelash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>G8648</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials 4ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Weathon</td>
<td>225012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iron plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nariscige</td>
<td>IP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>0226A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>0226B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Joystick micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual microsyringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electro Corporation</td>
<td>Shandon Finesse</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil, light</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>0121-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kopf</td>
<td>720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic molding cup tray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>16643A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WVR Scientific</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide warmer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage micrometer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wards </td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tilting base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TB 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P7949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>S6F</td>
<td>Dissecting microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>M205FA</td>
<td>Fluorescent microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury

In questo articolo abbiamo video di descrivere un modello di zebrafish di AKI con gentamicina come nephrotoxicant. La tecnica consiste in microiniezioni per via endovenosa, il 2 zebrafish dpf. Questa tecnica rappresenta un metodo efficace e rapido per fornire sostanze solubili nel sangue delle larve di zebrafish, permettendo l&#39;iniezione di pesce 15-20 all&#39;ora. Oltre agli studi di AKI, questa tecnica microiniezione può essere utilizzato anche per altri tipi di studi sperimentali come l&#39;angiografia. Forniamo un protocollo dettagliato della tecnica di attrezzature necessarie per le misure visiva della funzione renale ridotta. In aggiunta, abbiamo anche dimostrare il processo di fissazione, immunoistochimica montare tutto con un pennarello tubulo renale, di inclusione e sezionamento del pesce zebra larvale. Abbiamo dimostrato che le larve di zebrafish iniettati con gentamicina mostrare caratteristiche morfologiche coerenti con AKI: edema, perdita di polarità delle cellule in cellule tubulari prossimali epiteliali, e la rottura morfologica del tubulo.

Watch this Scientific Journal Video about Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury at JoVE.com

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Descriviamo una tecnica di microinjecting l&#39;aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

intravenous-microinjections-zebrafish-larvae-to-study-acute-kidney

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Views.  University of Pittsburgh. Descriviamo una tecnica di microinjecting l'aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Video: Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Ricerca

Biologia

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablazione laser del Pronephros Zebrafish allo Studio renale rigenerazione epiteliale

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage di larve Zebrafish

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...