のライブ解剖ショウジョウバエ胚：抗体染色によってミュータントコレクションをスクリーニングするための合理化手法

要約

我々は、特定の遺伝子型のショウジョウバエの胚の"フィレット"の準備を生成するための合理化プロトコルを記述する。このプロトコルは、遺伝子スクリーニングの様々な効率的な実行が可能になります。また、後期胚における構造物の優れた視覚化することができます。

要約

胚発生の段階で14と17との間のショウジョウバエの胚は、容易に"フィレット"の準備を生成するために解剖することができます。これらの製剤では、中枢神経系では、真ん中の下に実行され、ボディの壁に挟まれている。多くの異なる表現型は、このような調製物を用いて検討されています。ほとんどの場合、切り身は、抗体染色の固定ホールマウント胚の解剖によって生成されました。これらの"固定された解剖では、"しかし、いくつかの欠点を持っている。彼らは、実行には手間がかかる上に、​​それは突然変異がGFPのバランサー染色体にわたって維持されている銘柄から変異体（GFP陰性）胚をソートすることは困難です。 2002年以来、私たちのグループは、オーファン受容体に対するリガンドを同定するために欠乏し、異所性発現の画面に行ってきました。これを行うために、我々は生きている胎児の解剖とバランスのとれた、数百行を含むコレクションの抗体染色のための合理化されたプロトコルを開発した。我々はそれが固定された解剖ではなく、ライブ解剖による株式の大規模なコレクションの表現型を調べるためにかなり効率的であると結論付けている。ここで記述されたプロトコルを使用して、単一の訓練を受けた個人が化合物の顕微鏡下でそれぞれのラインから4月7日変異体胚を調べて、表現型の1日あたり10行まで選別できます。これは微妙な、低浸透表現型を付与する変異の同定を可能にする、行あたり最大70 hemisegments以降は40X水浸レンズと高倍率で採点されます。

プロトコル

はじめ

胚発生の段階で14と17との間のショウジョウバエの胚は、容易に"フィレット"の準備を生成するために解剖することができます。これらの製剤では、中枢神経系（CNS）は、真ん中の下に実行され、ボディの壁に挟まれている。腸は削除されます。準備との間に介在しない組織が ​​存在しないため、抗体で染色する場合、フィレットは、ホールマウントの胚に比べCNSと体壁の構造（ 例えば 、モータの軸索、筋肉、末梢感覚（PNS）の神経細胞、気管）のよりよい視覚化を許可するカバー、およびフィレットが体壁にまたがる構造は、単一の焦点面に可視化できるようにすること、平坦なので。多くの異なる表現型は、このような調製物を用いて検討されています。ほとんどの場合、フィレットは固定、抗体染色ホールマウント胚の解剖によって生成されます。これらの固定の製剤は、以下の手順によって生成されています：1）漂白剤と絨毛膜の除去は、2）パラホルムアルデヒド/ヘプタンとの固定、メタノール3）卵黄膜の除去、4）免疫組織化学または免疫蛍光を用いて抗体染色、5）グリセロールのクリア、6）タングステン針で解剖。これらの"固定解剖"を染色するための詳細なプロトコールは、文献に記載されています。 [1]。

固定解剖は、しかし、いくつかの欠点があります。最初に、それはしばしば変異が抗GFPを検出に使用されている場合でも、GFPバランサーでバランスされている株式や交配から固定、染色した変異体（GFP陰性）胚をソートすることは困難です。これは、GFPの母性発現を含む様々な要因によるものです。例えば、我々はそれがどちらアクチン- GFPまたはアルマジロ（腕）- GFPバランサーを使用してバランスのとれた第3染色体の株から、固定、染色されたホモ接合変異体胚をソートすることはほとんど不可能であることを見出した。第二に、それは高品質の固定解剖を生成するためにかなり時間がかかります。ほとんどの人がこれを行うことができるように時速10-15くらいの速度です。第三に、いくつかの抗体は、抗体のエピトープを修正するために敏感な、または汚れの内部と外部の両方の構造その抗体は、外部の構造によって"ずぶぬれ"されており、内部構造に浸​​透していないので（どちらため、固定された解剖でよく染色されないファシクリンIII（Fas3））に対して、例えば抗体。リガンドの発現を検出する受容体の融合タンパク質と第四に、ライブ染色は、固定の準備を行うことができます。

2002年以来、私たちのグループはRPTPリガンドを同定するために欠乏（DF）と異所性発現の画面に行ってきました。これを行うために、我々はバランスのとれた、数百行を含むコレクションの生きている胎児の解剖や染色のための合理化されたプロトコルを開発した。受容体の融合タンパク質とオーファン受容体のリガンドについての染色は多くのグループによって採用されていない特殊なアプリケーションです。しかし、多くのグループが胚の表現型を視覚化するためにフィレットの抗体染色を使用してください。これらのメソッドの我々の開発を通じ、我々はそれが固定された解剖ではなく、ライブ解剖による株式の大規模なコレクションの表現型を調べるためにかなり効率的であると結論付けている。我々は600以上のDFSでモーター軸索、神経、および筋肉の表現型を特徴づけるために、ライブ解剖を使用している、とも400以上の異なる細胞表面の異所性発現と分泌されるタンパク質（AW ら準備中で生成される神経系の表現型を特徴づけている。 HK。L. ら 、準備中）。

我々が使用したライブ解剖のプロトコルは、長年にわたって進化してきました。著者の一人（KZ）がまずコーリーグッドマンの研究室の大学院生だったNipamパテル、で20年以上前に解剖を生きるために導入されました。さらに近年では、我々は抗Fas3でCNSを染色するためにこのメソッドを使用する[2]、それ以外のすべての実験のための固定解剖を採用。 1999年には、その後Aloisiaシュミット、私たちのグループのポスドクは、私たちは彼女が二本鎖RNAを注入胚[3、4]の表現型を調べるために使用されるガラス針で解剖を生きるために導入。我々は数年後RPTPの配位子画面をやって始めたとき、我々はGFPバランサーにわたって維持株式の大規模なコレクションの迅速な分析を可能にするために彼女のプロトコルを変更。我々は、胚がGFPの発現でのライブと微妙な違いが容易に検出することができるソートされているため、実質的な母体のGFPの発現が（TM3armGFPバランサ用など ）、ある場合でもGFP陰性胚が容易にGFPバランス株からソートすることができることを見出した。ラールリガンドのための私たちの成功のDF画面は、[5]に記述されています。

私たちの現在のプロトコルを使用して、単一の訓練を受けた個人が化合物の顕微鏡下でそれぞれのラインから4月7日変異体胚を調べて、表現型のために一日あたりの5-10行を選別できます。胚を選択し、アレイ化した後、それは50胚を解剖するために約1時間かかります。このメソッドは、私たちは微妙な、低penetraを付与する変異を同定することができますNCEの表現型は、行あたり最大70 hemisegmentsので40X水浸レンズと高倍率で採点されます。そのような表現型は、解剖顕微鏡下で染色したホールマウント胚の画面に検出することが困難または不可能です。

我々は、約250行を含む、ゲノムの約半分（AW ら 、準備中）を表す表現型のスクリーニングのためのDFキットを定義している。それはRPTPのリガンドの合成[5]に必要な遺伝子のために2002年から2003年にかけて存在したこのキットの開発は、ブルーミントンDfはキットの私たちの画面の一部として開始されました。この画面のコースでは、我々は、DF / DFホモ接合体は、より良い開発を持っていた望ましい分子的にマップされて小さいのDFSとCNSを（したがって、中枢神経系リガンドの発現をスクリーニングすることができませんでした）、開発しなかったためにブルーミントンキットDFSを置き換え。

私たちの表現型のスクリーニング用キットのラインからDF / DFホモ接合体は、CNS、PNS、筋線維、気管ネットワーク、および他の多くの組織の発達に影響を及ぼす遺伝子の体系的に画面に捜査を可能にする、ステージ16で、通常の全体的な形態を持っている。任意の構造、発現パターン、またはステージ14から16で、特定の抗体やGFPマーカーと目に見えるようにできるか細胞内局在パターンは、このキットを使用して表現型をスクリーニングすることができます。これは彼の約半分の一人の支出、ここで記述されたプロトコルを使用して、こと/このプロジェクトの彼女の時間は、体系的に一年に6ヶ月以内に任意の胚の表現型のすべてのショウジョウバエの遺伝子の半分をスクリーニングすることができるということを意味します。

A. ショウジョウバエの胚のコレクション

1。 "5バレル"採卵室を準備する

これらのチャンバは、フライラインの大規模な数を調べる時間と労力を節約。

1. 逆さまにシリコンゴムの接着シールを使用して、一緒に100 × 15ミリメートルのプラスチックペトリ皿と接着剤のチューブをの下部にある5つ50mLのコニカルチューブを手配する。
2. 一度接着剤は接着剤は、ペトリ皿の底の部分は、管の円錐形の両端に、強化されています。五コニカルチューブは、ペトリ皿の内側に立っているだろう。
3. ホット針を用いて、空気循環用のチューブに穴を作る。

2。卵のコレクションプレートを準備

1. 各100 × 15ミリメートルのプラスチックシャーレにブドウ寒天ゲル（1％）の7mlの約を注ぐ。ゲルの理想的な厚さは、それぞれのコニカルチューブを密封するために、24時間水分を提供する3〜4 mm程度である。ゲルが厚すぎる場合、それは我々はプレートを変更するときに落ちる可能性があります。
2. ゲルプレートオフクール後に、カバーとオリジナルのプラスチック製のペトリ皿の袋にこれらを置く。しっかり袋をシールし、4℃で保存します。

3。ハエを準備

1. 正しいステージの胚を簡単に選択するための十分な卵を得るために、我々は> 20男性と一緒に、十字架に> 50の処女を入れてみてください。
2. クロスをスクリーニングする場合、男性と女性のハエを混在させるとの真ん中に植え底と薄い紙のストリップ上に乾燥酵母のペレットの多くが付いているフライ食品のバイアル（10 × 100ミリメートル、半分に折った）してください食べ物。紙のストリップはより多くの表面積を提供し、過度の湿気からハエを保持します。
3. 少なくとも3日間室温でハエでバイアルを保つ。
4. 瓶から株価が上映される場合は、単にコレクション室にハエを移す。

4。転送は五バレル採卵室に飛ぶ。

1. 採卵室の各樽にラベルを付けます。
2. 各バレルのための卵のコレクションプレートに酵母ペーストを置く。
3. 一緒にチャンバーとプレートを保持するために20インチの長いラベルのテープを準備します。簡単にプレートの変更のための各端から10 mmを折る。
4. ハエのバイアルにCO ₂ガスを注入し、標識樽にハエを移す。
5. 卵のコレクションプレートとチャンバーをカバーし、下に押します。
6. チャンバーと寒天プレートの真ん中から始めて一緒にプレート周りのテープ。テープは、卵のコレクションプレートに重なるだろう。

5。胚を集める

1. 卵のコレクションプレートを準備します：それぞれのバレルのための卵のコレクションプレートに酵母ペーストを入れます。
2. 採卵室のハエをタップして（しっかりと古いプレートを押さえ）チャンバーの周囲にテープを取り外します。
3. 再びハエをタップし、新しいものと古いプレートを交換してください。
4. 2-4時間のための斜めの位置に胚を収集する。
5. 希望の時間で卵のコレクションプレートを交換してください。

6。年齢の胚

ウェット90 mmの円形ろ紙で覆ったペトリ皿上に逆さまに卵のコレクションプレートを配置し、所望の温度で保つ。バランスの変異系統からステージ16胚の解剖のために、我々は一般的に昼前の収集を行う、その後のために胚をインキュベート19でR> 22時間° UAS/GAL4システムを使用して、機能獲得型研究のC.、我々は19で16時間、午後とインキュベートのRTでの胚を収集℃に次の日我々は、1または2時間UAS/GAL4システムをアクティブにするために29℃インキュベーターに胚を移す。この時間を過ぎると、解剖が行われるときにステージ16になるように、胚は、主にステージ15で、これはGFP発現のために胚をソートし、それらを整列するために十分な時間を確保できます。

7。胚をステージングし、GFPの発現のためにソート。

胚の遺伝子型を区別するために、我々はGFPバランサを使用してください。我々は、スコープを解剖オリンパスのGFPの下（次のセクションを参照）両面テープでdechorionated胚を調べて、そして我々は、同時に年齢とGFPの発現のためにそれらを選択してください。

A）GFPはソート：

1. 我々が使用する第二染色体のバランサー（CyOarmGFP）は外胚葉全体に発現しているアルマジロのプロモーターによって駆動されるGFPを、持っています。 CyOarmGFPのヘテロ接合体はオリーブグリーンです、とCyOarmGFPのホモ接合体は明るい緑色です。彼らはほとんどGFPの発現を（彼らはGFPバランサー付株式から胚のように見える）がないためCyoarmGFPの在庫あり、バランサーを欠く胚を簡単に、区別されます。
2. それはより多くの母体GFPの発現を牽引してきたので、第三染色体のバランサー（TM3armGFP）は、並べ替えに使用するのは難しいです。その結果、胚はより少ない緑のカテゴリに分かれています。いくつか練習すれば、それは通常、互いに以下、より緑の胚をソートするのは簡単ですが、転送後（TM3armGFPのヘテロ接合体）、それらをクラスタ化し、他のものより緑色な時折胚を抽出することで、それらを頼ることも必要です。寒天プレートに。そうでない場合は、不正確な遺伝子型のものであるいくつかの胚であることを確認しています。
3. XバランサはFM7 KR - GAL4、UAS - GFPです。これは、組織特異的なパターンで表現されます。ステージ15から16でソートに関連するパターンが頭の中で羊漿膜と表現の二点です、Bolwigの臓器の細胞である。残念ながら、1つは胚をソートしたいの段階で、羊漿膜はフェージングであるとBolwigの臓器は、まだ輝きを始めていない。それは、GFPのためにそれらを獲得するために、しばしば、それらをロールオーバー、したがって、テープ上の胚で非常に慎重にみる必要があり、そしてそれは、寒天プレート上に頼ることが不可欠です。通常、我々はこれを2回行います。一度直ちにプレートにテープからすべての胚を移動した後、再び単に解剖の準備のためにそれらを並べる前に、適切な段階に老化後。 GFPの可視化は、これらの条件下で優れているため、時には、我々はまた、PBSのプール（下記参照）への胚の転送後にGFPの範囲でスライドを再検討する。その後、我々は単に解剖を開始する前に、GFPを持つ胚を破壊することができます。

b）のステージング

STの周りに胚をステージングするための基本ツール。 14-16腸の形態です。 GFPのスコープの下で自家蛍光と消化管が点灯します。ステージの胚を試みる前に、その人が、彼 ​​らがどのようなものか理解できるよう、（ハルテンシュタインとカンポス-オルテガ緑の本など ）胚の写真や図を持っている参考図書やサイトに相談してください。解剖のための理想的なステージは、腸が三つのバンドに分割したときです。それ以前には、腸は、単一のblobとして表示されます。 One頻繁にソートブロブの段階で胚と、彼らは解剖のために最高のステージに到達するまで、それらを年齢。 3バンドのステージの後、腸内は対角尾近くのバンド、としてコイルを開発し始め、そして胚が明確になる。それは、スライドガラス上に付着されないため、この期間内に、胚は、解剖することが困難になる。一16/earlyステージ17胚の後期段階を分析する必要がある場合、それは多くの胚を解剖し、腸の形態が付着または付着しない胚に関連付けられているかを評価することが必要である。これは、同様に遺伝子型との間で多少異なります。

B. ショウジョウバエの胚のライブ解剖

1. 胚dechorionation
   1. スライド上に両面粘着テープとブドウのプレートのスラブを準備
   2. ウェット絵筆を使用した両面粘着テープにコレクションプレートから高齢胚を移す。均等に胚を広げる。
   3. 平滑解剖針で軽く越えて、それらを圧延して両面粘着テープの胚をDechorionate。 dechorionationした後、胚がないように強く、テープのような他の胚または絨毛膜に比べて針の端に、より強く固執しますが、、このため、1つのロール絨毛膜の上にまたは他の胚への胚、その後リフトそれオフとブドウプレートのスラブに転送します。遺伝子型と病期分類（詳細な説明については上記を参照すること）dechorionationの過程で行われ、針に移す。
   4. 遺伝子型と年齢のために頼らずにした後、行の10〜15胚から並べるのに十分な幅の寒天の小さい長方形のスラブ、に胚を移動する。手前に直面している寒天平板と後部の端に対して上下背側：このスラブ上dechorionated胚の位置を合わせます。我々は通常、50から10胚の行を作る。
2. ライブ解剖用のスライドと、転送胚を準備
   1. 両面粘着テープの小さな長方形の部分をカットし、スーパーフロスト/プラススラ​​イド（フィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号12-550-15）の一方の端の近くに置きます。
   2. ワックスとテープ（スーパーHTのパップペン、間にスペースの約3 mmはあるように、ワックスペンとテープの周りに長方形（長さ30〜40ミリメートル、およびスライドの全幅を）描くwww.rpicorp。 COM ）とは、反転スライドによって、テープへのブドウプレートのスラブから胚を転送し、静かにテープが並ぶアップ胚（解剖範囲の下で行われる）と接触するように、胚にそれを低下させる。胚は、後端が手前になるように調整する必要があります。彼らは今、スライド上に背側になります。
   3. すぐにワックスの長方形を埋めるために胚以上の1X PBSを（ギブコのレシピ）に追加します。
3. 胚ライブ解剖
   1. ガラスの解剖針を（注射針から作られる）を使用して、胚の後端から始まる、背側正中線に沿って切断。
   2. 胚の前端を突く、持ち上げ、それが付くまで、スライドに胚を移す。バッファ内に胚を保持。寒天平板にそれぞれの行に一致するスライドに胚の整然としたラインを作る。彼らはすべてのスライドに収まるように行を整理する。
   3. フィレットを生成するために使用される可能性のある解剖シーケンスのさまざまなものがあります。人々は通常、解剖そのものを行うことを通じて、独自の最適化された手順を開発する。ビデオは、小さなカットが互いにから体壁の両側を分離するために胚の後端に行われる順序を示しています。必要に応じて、一つでもこのカットと腸/腸接続を破ることができる、と（ビデオでは、後腸変位は後で実行される）この時点でスライドに後腸を置き換える。その後、カットは、脳から体壁を分離するために、脳ローブにちょうど後部両側に作られています。胚の年齢に応じて、一つはまた、体壁の間にamnioserosal接続を切断するために背側正中線の下の浅いカットを作成する必要があるかもしれません。
   4. その後、静かにそれを伸ばしたり、それらの表面から材料を除去回避、スライド上に体壁のフラップを下に貼り付けます。これが最善だけ針が体壁の背側縁部に前部と後部の角を接触させることによって行われます。モーターの軸索は、はるかに背側にこれを拡張していないので、最良のケースでこれは完全に無傷のISNの支店を持つ胚を生成します。胚が常に背側正中線に沿って正確に分離していないため、場合によってはISNは、さらに最高のテクニックで、切り捨てられます。正しく行えば、このメソッドは（約）T3 - A6のセグメントで体壁の構造が保持されます。
   5. 一つは、胚の上に中腸のままにして、[すべての解剖を終えた後にすべて切除した胚からそれを削除することができます。これは、腸を突っつい胚から離れて置換し、そして脳葉の下にある前腸、その接続を切断するため、それをストレッチすることによって行われます。もそれを完了するか、人はそれぞれの解剖から腸を削除することができます。腸から放出さ卵黄はそれがより困難doublestickのテープからの転送後にスライドする後、転送胚を固執することができるから異常な腸の発達を持っている突然変異体で、それは、解剖を終えた後に一度にすべての内臓を除去するために有利である。卵黄が原因で針の典型的な動きをすることに向かって広がる傾向にあるとして、それは、スライドの下部にある（あなたに向かって）ではなく、上部に開始する胚を転送すると便利な場合があります。
4. 固定および免疫蛍光/免疫組織化学
   1. 一リガンドの発現を検出するために、ライブ染色実験を行っている場合、いずれかの抗体で染色され、またはいずれかのPBSを除去し、融合タンパク質を上清に置き換えることができればこの時点で、人は、すぐに胚を修正することができますどちらか。実験のこの側面は、refの方法と補足方法のセクションで詳細に説明されています。 [5]。
   2. ここでは、すぐに、または融合タンパク質染色後に行われている固定プロトコールを、説明します。 twoパスツールピペットを用いて、PBSで5％のパラホルムアルデヒドを含むPBSを置き換える（EMS、カタログ番号15713 - S、www.emsdiasum.com）。パスツールピペットを保持しているため、修正液の〜6mlを使用して関与する修正溶液中で交換三回、ソリューションの1.5〜2ミリリットル。 45'を修正。
   3. 解決策を修正削除する、PBTとし、PBS（3変化）に置き換える（PBS + 0.1％トリトンX - 100 + 1 mg / mlのフラクションV BSA、3の変更）、その後〜200μlのブロックソリューション（とPBTを置き換えるPBT + 5 ％は、熱処理された正常ヤギ血清）、その後、ブロックの溶液中で所望の一次抗体を持つ。彼らはPBSでいる間、これは解剖を破壊するとして、それは、メニスカスは特に、胚に接触させたりしないことが非常に重要です。洗剤が追加された後の胚は、メニスカスの影響を受けにくくなる。このように、人はスライドを傾けると、ワックスで囲まれた領域のコーナーに簡単にキムワイプを触れることで、最も解のをオフブロッティングによりブロックとPBTを置き換えることができます。同法は、抗体溶液とブロックを置き換えるために使用することができます。これは、ソリューションのキャリーオーバーを最小限に抑えます。
   4. 4℃で一晩インキュベートして、ロッキングプラットフォーム（PBTは、スライドが常に完全に揺動中に浸漬されるように十分あることを確認してください）​​上のトレイにあるPBT（> 15分/洗浄）と3X洗浄、再ブロックは、上述したように、 200μlの二次抗体を加える、2時間インキュベートする。でRT、PBTで洗い直す。範囲を解剖GFPの下に必要に応じて染色（緑色の蛍光が使用されている場合）を確認してください。
   5. PBS（5'）で2Xを洗って、その後4℃で一晩500μlの70パーセントglycerol/1X PBS（50mlチューブに35mlのグリセロール5 mlの10 × PBS、および10mlの水を混合して作った）、そして明確なを追加° C （または室温で2時間）。グリセロールを削除し、＃1カバースリップに置く。

ディスカッション

我々は、このビデオのデモは、それらが今容易にショウジョウバエの遺伝学と発生学のいくつかの経験を有する者により実行可能であることを十分に詳細で生きている胎児の解剖や染色のために我々の方法を表示していることを願っています。もちろん、かなりの練習が依然として主に解剖自身のために、必要となります。我々の経験では、ライブ解剖の方法を学ぶすべての人は彼/彼...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9