Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание

Резюме

Мы описываем обтекаемый протокол для создания "филе" препараты эмбрионов дрозофилы конкретных генотипов. Этот протокол позволяет эффективного выполнения различных генетических экранов. Она также позволяет отличную визуализацию структур в конце эмбриона.

Аннотация

Дрозофилы эмбрионов между этапами 14 и 17 эмбрионального развития может быть легко расчлененный для создания "филе" препаратов. В этих препаратов, центральная нервная система работает по середине, и в окружении теле стены. Многие различные фенотипы были изучены с помощью таких препаратов. В большинстве случаев, филе были получены путем рассечения антител окрашенных фиксированных целом монтажа эмбрионов. Эти «фиксированные вскрытия" есть некоторые недостатки. Они отнимают много времени для выполнения, а это трудно разобраться мутант (GFP-отрицательный) эмбрионы от акций, в которых мутации хромосом сохраняется в течение GFP балансировки. С 2002 года наша группа ведет дефицит и внематочной экраны выражение для идентификации лигандов для детей-сирот рецепторов. Для того, чтобы сделать это, мы разработали обтекаемый протоколов для живых рассечение эмбриона и антител окрашивание коллекций, содержащих сотни симметричные линии. Мы пришли к выводу, что это значительно более эффективным для изучения фенотипов в больших коллекций запасы живой рассечение, чем фиксированной рассечение. Использование протокола, описанные здесь, один обученный человек может экрана до 10 строк в день в течение фенотипы, рассматривая 4-7 мутантных эмбрионов из каждой строки под соединение микроскопа. Это позволяет идентифицировать мутации присвоении тонкие, низко-фенотипы пенетрантностью, так как до 70 hemisegments в строке засчитываются при большом увеличении с 40X воды погружения линз.

протокол

Введение

Дрозофилы эмбрионов между этапами 14 и 17 эмбрионального развития может быть легко расчлененный для создания "филе" препаратов. В этих препаратов, центральной нервной системы (ЦНС) проходит по середине, и в окружении теле стены. Кишка удаляется. При окраске с антителами, филе позволяют гораздо лучше визуализации ЦНС и стенки тела структур (например, аксоны двигателя, мышц, периферических сенсорных (PNS) нейронов, трахеи), чем весь монтаж эмбрионов, потому что нет никакой промежуточной ткани между подготовкой и покровное, и потому, филе плоские, позволяя структур, которые распространяются по всему телу стены, чтобы быть визуализированы в одной фокальной плоскости. Многие различные фенотипы были изучены с помощью таких препаратов. В большинстве случаев, филе генерируются рассечение фиксированной, антитела окрашивали целом монтажа эмбрионов. Эти фиксированные препараты порожденных следующие шаги: 1) хориона удаления с отбеливателем, 2) фиксация параформальдегид / гептан, 3) желточной мембраны удаления с метанолом, 4) антитела окрашивания использованием иммуногистохимии или иммунофлюоресценции, 5) оформление в глицерин; 6) рассечение с вольфрамовыми иглами. Подробные протоколы для окрашивания эти "фиксированные вскрытия" предоставляются в работе. [1].

Исправлена ​​вскрытия имеют некоторые недостатки, однако. Во-первых, часто трудно разобраться фиксированных, окрашенных мутант (GFP-отрицательный) эмбрионов со складов или крестов, в которых мутации более сбалансированной GFP балансиры, даже когда анти-GFP используется для обнаружения. Это связано с рядом факторов, включая материнскую выражения GFP. Например, мы обнаружили, что это почти невозможно для сортировки фиксированных, окрашенных гомозиготных мутантных эмбрионов от сбалансированной третьей хромосоме акции с использованием либо актин-GFP или броненосца (рука)-GFP балансиры. Во-вторых, это довольно много времени для создания высококачественной фиксированной вскрытия. 10-15 в час примерно так же быстро, как большинство людей могут это сделать. В-третьих, некоторые антитела не хорошо окрашиваются в основной вскрытия, либо потому, что антитела эпитопов чувствительны исправить, или потому, что антитела, которые пятна внутренних и внешних структур "впитывал" внешними структурами и не проникает на внутренние структуры ( например, антитела против fasciclin III (Fas3)). В-четвертых, жить окрашивания рецепторные белки слияния обнаружить лиганд выражение не может быть сделано на фиксированных препаратах.

С 2002 года наша группа ведет дефицит (D) и внематочной экраны выражение для определения RPTP лигандами. Для того, чтобы сделать это, мы разработали обтекаемый протоколов для живых рассечение эмбриона и окрашивание коллекций, содержащих сотни симметричные линии. Окрашивание для детей-сирот лигандами рецептора с белками рецепторов синтеза специализированных приложений, который не использовался многими группами. Тем не менее, многие группы используют антитела, окрашивание филе для визуализации эмбриональных фенотипы. Благодаря нашей разработке этих методов, мы пришли к выводу, что это значительно более эффективным для изучения фенотипов в больших коллекций запасы живой рассечение, чем фиксированной рассечение. Мы использовали живой рассечение для характеристики двигателя аксона, центральной нервной системы, мышц и фенотипов в более чем 600 Dfs, а также характеризуется нервной системы фенотипы производства эктопической экспрессии более чем 400 различных клеточной поверхности и секретируемых белков (AW и др. в подготовке. HK. L. и соавт., в стадии подготовки).

Жить протоколы вскрытия мы использовали развивались в течение многих лет. Один из авторов (KZ) впервые был введен, чтобы жить рассечение более чем 20 лет назад Nipam Патель, который тогда был аспирантом в лаборатории Кори Гудман. В последние годы, мы использовали этот метод, чтобы пятно ЦНС с анти-Fas3 [2], но занятых фиксированной вскрытия для всех других экспериментов. В 1999 году, Алоизия Шмид, то постдок в нашей группе, познакомил нас с живой рассечение со стеклянной иглы, которую она использовала для изучения фенотипов в двухцепочечной РНК впрыском эмбрионов [3, 4]. Когда мы начали делать лиганд RPTP экраны спустя несколько лет, мы модифицировали ее протоколов для обеспечения быстрого анализа больших коллекций акций сохраняется в течение GFP балансиры. Мы обнаружили, что GFP-отрицательные эмбрионы могут быть упорядочены с GFP-сбалансированный акции даже тогда, когда есть существенные материнской выражения GFP (например, для балансировки TM3armGFP), так как эмбрионы сортируются жить и тонкие различия в выражении GFP может быть легко обнаружен. Наше успешное экране Df для Лар лиганд описана в [5].

Использование наших нынешних протоколов, один обученный человек может экрана 5-10 строк в день в течение фенотипы, рассматривая 4-7 мутантных эмбрионов из каждой строки под соединение микроскопа. После выбора и arraying эмбрионов, она занимает около одного часа, чтобы рассекать 50 эмбрионов. Этот метод позволяет выявить мутации присвоении тонкие, низко-проникновенияNCE фенотипы, так как до 70 hemisegments в строке оцениваются при большом увеличении с 40X воды погружения линз. Такие фенотипы было бы трудно или невозможно обнаружить в экраны из цветного целом монтажа эмбрионов при вскрытии микроскопом.

Мы определили Df комплект для фенотипического скрининга, которая содержит около 250 строк и представляет около половины генома (AW и соавт., В стадии подготовки). Развитие этого комплекта было начато в рамках нашего экрана Блумингтон Df комплект, как она существовала в 2002-2003 годах на гены, необходимые для RPTP лиганд синтеза [5]. В ходе этого экрана, мы заменили Блумингтон комплект Dfs, для которых Df / Df гомозигот не развивались ЦНС (и, следовательно, не мог пройти обследование на выражение лигандом ЦНС) с меньшими Dfs, предпочтительно молекулярно на карту, которая лучше развитию.

Df / Df гомозигот из линий в нашей фенотипические комплект скрининга нормальной общей морфологии на стадии 16, что позволяет следователю систематически экран для генов, влияющих на развитие ЦНС, ПНС, мышечных волокон, трахеи сети, а также многие другие ткани. Любая структура, экспрессия узор или рисунок субклеточные локализации, которая наглядное со специфическим антителом или GFP маркером на этапах 14-16 можете пройти обследование на фенотипы с помощью этого комплекта. Это означает, что, используя протокол, описанный здесь, один человек потратив около половины его / ее время на этот проект мог бы систематически экране половины всех генов дрозофилы для любого желаемого эмбрионального фенотипа в течение шести месяцев до одного года.

А. дрозофилы эмбриона коллекции

1. Подготовка «Пять-бочка" камер сбора яиц

Эти камеры сэкономить время и усилия при рассмотрении большого количества летать линий.

1. Упорядочить пять 50 мл конические пробирки с ног на голову на нижнюю часть 100 х 15 мм пластиковые чашки Петри и клей трубы вместе с помощью силиконовой резины клей-герметик.
2. Как только клей затвердел, клей нижней части чашки Петри на конические концы труб. Пять конических труб будет стоять внутри чашки Петри.
3. Использование горячей иглы, сделать отверстия в трубах для циркуляции воздуха.

2. Подготовка пластин сбора яиц

1. Налейте около 7 мл виноградного гель агар (1%), в каждой 100 х 15 мм, пластиковые чашки Петри. Идеальная толщина геля составляет около 3-4 мм, чтобы запечатать каждой конической трубе и обеспечить влагой в течение 24 часов. Если гель является слишком толстым, он может упасть, когда мы меняем пластины.
2. После остыть гель пластин, накрыть крышкой и поместить их в пластиковый пакет оригинальные чашки Петри. Печать сумка плотно и хранить при 4 ° C.

3. Подготовка мух

1. Для того чтобы получить достаточно яйца для легкого выбора эмбрионов правильный этап, мы стараемся поставить> 50 дев в крест, вместе с> 20 мужчин.
2. Если крест, чтобы пройти обследование, смешать мужского и женского мух и иметь в флаконе летать пищи с большим количеством сухих гранул дрожжей на дне и тонкая полоска бумаги (10 X 100 мм, сложенный пополам) установлены в середине пищи. Бумажной полоске обеспечит большую площадь поверхности и мух в условиях повышенной влажности.
3. Хранить флаконы с мухами при комнатной температуре в течение 3 дней.
4. Если запас из бутылки, чтобы пройти обследование, просто передача летит в сборной камере.

4. Передача летит в пяти камерах баррель сбора яиц.

1. Этикетка каждый баррель камер сбора яиц.
2. Положите дрожжи пасты на пластине сбора яиц за каждый баррель.
3. Подготовка 20 дюймов длинной ленты маркировки держать камеру и пластины вместе. Сложите 10 мм от каждого края для легкой смены пластины.
4. Inject СО ₂ в лету флаконов и передача летит в меченых баррелей.
5. Обложка камера с пластиной сбор яиц и нажмите вниз.
6. Лента вокруг камеры и пластины вместе, начиная с середины агар пластины. Лента будет пересекаться на тарелке сбор яиц.

5. Сбор эмбрионов

1. Подготовка пластины сбор яиц: Положите дрожжи пасты на пластине сбора яиц за каждый баррель.
2. Нажмите вниз летит в камерах сбор яиц и удалить ленту вокруг камеры (Hold старые пластины плотно).
3. Нажмите вниз мухи снова и заменить старую пластинку с новым.
4. Сбор эмбрионов в наклонном положении в течение 2-4 часов.
5. Замените пластину сбора яиц в нужное время.

6. Возраст эмбрионов

Место пластины сбора яиц, положите его на покрытый Петри пластины с мокрым 90 мм круг фильтровальной бумаги и держать на желаемой температуры. Для вскрытия этап 16 эмбрионов из сбалансированной мутантных линий, мы, как правило, коллекции в поздним утром, то инкубации эмбрионовг> 22 часов при температуре 19 ° С. Для усиления-функции исследования с использованием UAS/GAL4 система, которую мы получаем эмбрионы при комнатной температуре во второй половине дня и инкубировать в течение 16 ч при 19 ° C. На следующий день мы передаем эмбрионов 29 ° C инкубатор для активации UAS/GAL4 системы в течение 1 или 2 часа. После этого количество времени, эмбрионы в основном этапе 15, и это дает достаточно времени для сортировки эмбрионов для GFP выражения и выстроить их, таким образом, что они будут на стадии 16, когда вскрытие делается.

7. Постановка эмбрионов и сортировки для GFP выражения.

Чтобы различать генотипы эмбрионов, мы используем GFP балансиры. Мы рассматриваем dechorionated эмбрионов на двойной палки лентой (см. следующий раздел) в рамках Olympus GFP рассекает сферу, и мы выбираем их по возрасту и GFP выражение в то же время.

а) GFP сортировки:

1. Второй балансировки хромосомы мы используем (CyOarmGFP) имеет GFP обусловлен броненосца промоутер, который выражается во всем эктодермы. CyOarmGFP гетерозиготы оливково-зеленый, а CyOarmGFP гомозиготы имеют ярко-зеленый. В акции CyoarmGFP, эмбрионы, которые не имеют балансировки легко отличить, потому что они почти не имеют GFP выражения (они выглядят как эмбрионы из фондовых без каких-либо GFP балансировки).
2. Третий балансировки хромосомы (TM3armGFP) труднее использовать для сортировки, потому что она имеет более матерински приводом GFP выражения. В результате эмбрионов делятся на более и менее зеленый категорий. С некоторой практике это обычно не вызывает затруднений для сортировки меньше и больше зеленых эмбрионы друг от друга, но это также приходится прибегать их кластеризации их и выбирая случайные эмбрионов, которые являются более зеленый, чем другие (TM3armGFP гетерозигот) после перевода на агар пластины. В противном случае, Есть обязательно будет несколько эмбрионов, которые имеют неправильное генотипа.
3. Балансировки Х FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Это выражается в тканеспецифические узор. Модели, которые имеют отношение к сортировке на этапах 15-16 являются amnioserosa и две точки выражение в голове, которые орган Bolwig клеток. К сожалению, на стадии, когда кто-то хочет рода эмбрионов, amnioserosa исчезает и органов Bolwig это еще не начали светиться. Таким образом, необходимо крайне внимательно отнестись эмбрионов на ленте, часто подвижного их, чтобы выиграть их для GFP, и это имеет важное значение для курорта их на агар пластины. Обычно мы делаем это дважды: один раз сразу после перемещения всех эмбрионов с ленты на плиту, и снова после старения на соответствующем этапе, как раз перед подкладка их в подготовке к рассечение. Иногда мы также пересмотреть слайд под GFP размах после передачи эмбрионов в бассейн PBS (см. ниже), так как визуализация GFP лучше в этих условиях. Затем, мы можем уничтожить эмбрионы, которые GFP непосредственно перед началом вскрытия.

б) Постановка

Основным средством для постановки эмбрионов вокруг ул. 14-16 в кишечнике морфологии. Кишечнике сияет аутофлюоресценция под GFP области. До попытку провести эмбрионов, следует проконсультироваться справочников или сайтов, которые имеют картинкам и диаграммам эмбрионов (например, Хартенштайн и Кампос-Ортеги зеленую книгу), так что не понимает, что они должны выглядеть. Идеальная сцена для вскрытия, когда кишка разделены на три группы. До этого кишка выглядит как одна капля. Часто виды эмбрионов на стадии капли, а затем возрастов их, пока они не достигнут лучший этап для вскрытия. После трехполосный этапе, кишечник начинает развиваться диагональные полосы вблизи хвоста, а затем катушки, и зародыш становится более четким. В течение этого периода эмбрион становится трудно анализировать, поскольку он не будет придерживаться на стекле. Если человек хочет препарировать поздней стадии 16/early стадия 17 эмбрионов, необходимо анализировать многие эмбрионы и оценить, какие кишки морфологии связаны с эмбрионами, которые приклеиваются или не прилипают. Это несколько различается между генотипами, а также.

Б. дрозофилы эмбрион живой рассечение

1. Эмбрион dechorionation
   1. Подготовка двусторонней клейкой ленты и плиты виноградных пластину на слайд
   2. Трансфер в возрасте эмбрионов из коллекции пластину двусторонней клейкой ленты использованием мокрой кистью. Распространение эмбрионов равномерно.
   3. Dechorionate эмбрионов на двусторонней клейкой ленты прокаткой их через нее осторожно притупляются рассекает иглы. После dechorionation, эмбрионы будут придерживаться более убедительно свидетельствуют о конце иглы, чем для других эмбрионов или хорион, но не так сильно, как на ленту, таким образом один рулонах эмбрионов в верхней части хориона или на других эмбрионов, то подъемников его и передает ее на плиту винограда пластины. Генотипирование и постановка (см. выше, для подробного описания) осуществляется в процессе dechorionation итрансфер в иглу.
   4. После прибегая для генотипа и возраста, двигаться эмбрионов в меньшей прямоугольной плиты агара, достаточной ширины, чтобы выстраивались по 10-15 эмбрионов в ряд. Совместите dechorionated эмбрионов на этой плите: спинной стороной вниз против агар плиты и задний концы были обращены к вам. Мы обычно делают рядами 5-10 эмбрионов.
2. Подготовка слайд-шоу и передачи эмбрионов для живых рассечение
   1. Вырезать небольшой прямоугольный кусок двусторонней клейкой лентой и поместите ее около одного из концов Супер Фрост / Plus слайд (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Нарисуйте прямоугольник (30-40 мм в длину, и по всей ширине слайд) вокруг ленты с воском пера, так что есть ~ 3 мм пространства между воском и лентой (Super HT Пап Пен, www.rpicorp. COM ) и передача эмбрионов из винограда плита пластины на ленту, обращая слайдов и осторожно опуская его на эмбрионах, так что лента входит в контакт с выстроились деятельности эмбрионов (делается под рассекает области). Эмбрионы должны быть расположены так, что задний конец направлен в вашу сторону. Теперь они будут спинной стороной вверх на слайде.
   3. Сразу же добавить 1X PBS (Gibco рецепт) по сравнению с эмбрионами, чтобы заполнить воском прямоугольника.
3. Эмбрион жить рассечение
   1. Использование иглы стекла рассечение (из инъекционной иглой), разрезать вдоль спинной средней линии, начиная от заднего конца зародыша.
   2. Пока переднем конце зародыша, поднимите и передачи эмбриона на слайд, пока не палками. Держите эмбрионов в буфере. Сделать упорядоченного линии эмбриона на слайде, который соответствует каждой строки на агар плиты. Организация строк так, чтобы они легко поместятся на слайде.
   3. Есть целый ряд возможных последовательностей рассечение, которое может быть использовано в производстве филе. Люди обычно разрабатывают свои собственные оптимизированные процедуры, с помощью делать вскрытия себя. Видео демонстрирует последовательность, в которой небольшой надрез на заднем конце эмбриона отделить две стороны стенки тела друг от друга. При желании, можно также разрыв кишки / кишке связи с этим сокращение, и вытеснять кишке выходят на слайде в это время (в видео, смещение задней кишки делается позже). Затем, порезы сделаны с обеих сторон только задние в мозг доли того, чтобы отделить тело стены от мозга. В зависимости от возраста эмбриона, можно также должны сделать мелкий сократить спинной средней линии, чтобы разорвать связь между amnioserosal стенки кузова.
   4. Затем, осторожно вставлять вниз закрылки стенки тела на слайд, избегая растягивая их или удаления материала с их поверхности. Лучше всего это делать, позволяя лишь иглу, чтобы связаться передний и задний углы в спинной края стенки тела. Двигателя аксонов не распространяются так далеко в верхней части, так что в лучшем случае это будет производить эмбриона с совершенно нетронутыми отраслей ISN. В некоторых случаях ISN будут усечены, даже с лучшей техникой, потому что эмбрион не всегда точно по отдельным спинной средней линии. Если все сделано правильно, то этот метод сохранения структуры стенки тела в сегментах T3-А6 (приблизительно).
   5. Можно оставить кишки в верхней части эмбриона, а затем удалить его из всех расчлененный эмбрионов после окончания всех вскрытий. Это делается, тыкая кишечника, вытесняя его из эмбриона, и растягивая ее, чтобы сломить ее подключения к передней кишки, который находится под мозгом долей. Или, можно удалить кишечник от каждого вскрытия как один дополняет ее. С мутантов, аномалии развития кишки, это преимущество, чтобы удалить все внутренности сразу после окончания вскрытия, так как желток освобожден из кишечника может сделать его более трудно придерживаться позже переданы эмбрионов к слайду при переходе от doublestick ленты . Это иногда полезно для передачи эмбрионов, начиная с нижней части слайда (по направлению к себе), а не на вершине, а желток имеет тенденцию к распространению по отношению к вам из-за типичного движения иглы.
4. Фиксация и иммунофлюоресценции / иммуногистохимии
   1. На данный момент, можно либо исправить эмбрионов немедленно, если он окрашивание с антителами, или можно удалить PBS и заменить его на слияние супернатант белка, если он делает живой эксперимент окрашивания обнаружить лиганд выражения. Этот аспект эксперимента подробно описаны в Методы и дополнительные методы разделы реф. [5].
   2. Здесь мы опишем фиксации протокол, в котором осуществляется либо сразу, либо после слияния окрашивание белка. Использование двух Пастера пипетки, заменить PBS с 5% параформальдегида в ФСБ (EMS, Кат. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Обмен в решение исправить три раза, что связано с использованием ~ 6 мл исправить решение, так как пипетки Пастера держит1,5-2 мл раствора. Исправление для 45 '.
   3. Удалить исправить решение, заменить PBS (3 изменения), то с PBT (PBS + 0,1% Тритон Х-100 + 1 мг / мл БСА доля V, 3 изменения), а затем заменить PBT с ~ 200 мкл раствора блок (PBT + 5 % термообработанной нормальной козьей сывороткой), то с нужным первичных антител в блоке решения. Это очень важно, чтобы не допустить мениска связаться эмбрионов, особенно когда они находятся в PBS, так как это уничтожит вскрытия. После моющего средства добавляется эмбрионов становятся менее чувствительными к мениска. Таким образом, можно заменить PBT с блоком, опрокинув слайдов и промокательной от большинства решений, касаясь Kimwipe кратко углу площади, ограниченной воска. Тот же метод может быть использован для замены блока с анти решение тела. Это сводит к минимуму унос решений.
   4. Выдержите в течение ночи при 4 ° С, затем промыть 3X с PBT (> 15 минут / стирка) в лоток на качалке платформы (убедитесь, что есть достаточно ПБТ, так что слайд всегда полностью погружен при укачивании), reblock как описано выше, добавить 200 мкл вторичными антителами, инкубировать 2 часа. при комнатной температуре, rewash с PBT. Проверьте окрашивания (если зеленая флуоресценция используется) при желании под GFP рассекает области.
   5. Вымойте 2X с PBS (5 '), затем добавить 500 мкл 70% glycerol/1X PBS (путем смешения 35 мл глицерина, 5 мл 10 раз PBS, и 10 мл воды в 50 мл трубки), и ясно ночь при 4 ° C (или в течение 2 часов при комнатной температуре). Удалить глицерином и поставить на # 1 покровное.

Обсуждение

Мы надеемся, что это видео демонстрация показала наши методы для живых рассечение эмбриона и окрашивания достаточно подробно, что теперь они могут быть легко выполнен любым лицом, которое имеет некоторый опыт дрозофилы генетики и эмбриологии. Конечно, значительную практику все е?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate Tubing With Filament	Sutter Instrument Co.	BF120-60-10
Narishige model PC-10 needle puller	Narishige International		Tubes pulled using a heater level of 58.9