Dissecação ao vivo de Drosophila Embriões: Métodos ágeis para Screening Coleções Mutant pela coloração de anticorpos

Resumo

Nós descrevemos um protocolo simplificado para a geração de "filé" preparações de embriões Drosophila de genótipos específicos. Este protocolo permite a execução eficiente de uma variedade de telas genética. Ele também permite excelente visualização das estruturas do embrião tarde.

Resumo

Embriões Drosophila entre os estágios 14 e 17 do desenvolvimento embrionário pode ser facilmente dissecados para gerar "filé" preparativos. Nessas preparações, o sistema nervoso central funciona abaixo do meio, e é ladeado por paredes corpo. Muitos fenótipos diferentes foram examinados usando tais preparações. Na maioria dos casos, os filés foram gerados por meio de dissecção de anticorpos manchada fixo todo mount-embriões. Estes "dissecções fixo" têm algumas desvantagens, no entanto. Eles são demorados para executar, e é difícil de classificar mutante (GFP-negativo) embriões de ações em que as mutações são mantidos ao longo cromossomos balanceador de GFP. Desde 2002, nosso grupo vem realizando deficiência e telas de expressão ectópica de identificar ligantes de receptores órfãos. A fim de fazer isso, desenvolvemos protocolos simplificados para dissecção embrião vivo e coloração de anticorpos de coleções contendo centenas de linhas balanceadas. Concluímos que é consideravelmente mais eficiente para analisar fenótipos em grandes coleções de stocks por dissecção ao vivo do que pela dissecção fixo. Utilizando o protocolo descrito aqui, um único indivíduo treinado pode tela de até 10 linhas por dia para fenótipos, examinando 4-7 embriões mutantes de cada linha em um microscópio composto. Isto permite a identificação de mutações conferindo sutil, de baixa penetrância fenótipos, uma vez que até 70 hemisegments por linha são marcados em grandes ampliações com uma lente de imersão em água 40X.

Protocolo

Introdução

Embriões Drosophila entre os estágios 14 e 17 do desenvolvimento embrionário pode ser facilmente dissecados para gerar "filé" preparativos. Nessas preparações, o sistema nervoso central (SNC) é executado no meio, e é ladeado por paredes corpo. O intestino é removida. Quando corados com anticorpos, filetes de permitir a visualização muito melhor do CNS e estruturas do corpo de parede (axônios motores, por exemplo, músculos periféricos sensoriais (PNS) neurônios, traquéias) do que montar todo-embriões, porque não há nenhum tecido intermediário entre a preparação ea lamela, e porque filetes são planas, permitindo que as estruturas que se estendem da parede do corpo para ser visualizado em um único plano focal. Muitos fenótipos diferentes foram examinados usando tais preparações. Na maioria dos casos, os filetes são gerados por dissecção da fixa, o anticorpo-corado todo mount-embriões. Estas preparações fixas são gerados pelas seguintes etapas: 1) remoção córion com lixívia; duas fixação) com paraformaldeído / heptano; coloração de anticorpos 4) utilizando imuno-histoquímica ou imunofluorescência;; 3) a remoção da membrana vitelina com metanol 5) clearing em glicerol; 6) dissecção com agulhas de tungstênio. Protocolos detalhados para a coloração destas "dissecções fixo" são fornecidos em ref. [1].

Dissecções fixos têm algumas desvantagens, no entanto. Em primeiro lugar, muitas vezes é difícil de classificar fixo, mutante coradas (GFP-negativo) embriões de ações ou cruzes em que as mutações são mais equilibrados GFP balanceadores, mesmo quando anti-GFP é utilizada para detecção. Isto é devido a uma variedade de fatores, incluindo a expressão maternal da GFP. Por exemplo, descobrimos que é quase impossível de classificar fixados, corados embriões homozigotos mutantes de ser equilibrado stocks terceiro cromossomo usando GFP-actina ou tatu (braço)-GFP balanceadores. Em segundo lugar, é muito demorado para gerar alta qualidade dissecções fixo. 10-15 por hora é quase tão rápido quanto a maioria das pessoas pode fazer isso. Terceiro, alguns anticorpos não mancha bem em dissecções fixa, seja porque os epítopos dos anticorpos são sensíveis para corrigir, ou porque um anticorpo que manchas de ambas as estruturas interna e externa é "absorvido" pelo estruturas externas e não penetra nas estruturas internas ( anticorpos por exemplo, contra fasciclin III (Fas3)). Coloração, quarto vivo com proteínas de fusão receptor para detectar a expressão do ligante não pode ser feito sobre os preparativos fixo.

Desde 2002, nosso grupo vem realizando deficiência (Df) e telas de expressão ectópica de identificar ligantes RPTP. A fim de fazer isso, desenvolvemos protocolos simplificados para dissecção embrião vivo e coloração das coleções contendo centenas de linhas balanceadas. Coloração para ligantes do receptor órfão com proteínas de fusão do receptor é uma aplicação especializada que não é empregado por muitos grupos. No entanto, muitos grupos usam anticorpos coloração de filés de visualizar fenótipos embrionárias. Através do nosso desenvolvimento desses métodos, concluímos que é consideravelmente mais eficiente para analisar fenótipos em grandes coleções de stocks por dissecção ao vivo do que pela dissecção fixo. Temos usado dissecção ao vivo para caracterizar motor de axônio, CNS, e fenótipos musculares em mais de 600 DFS, e também caracterizado fenótipos do sistema nervoso produzido pela expressão ectópica de mais de 400 diferentes superfície da célula e as proteínas secretadas (AW et al, em preparação.; HK. L. et al., em preparação).

Os protocolos de dissecção viver temos usado evoluíram ao longo dos anos. Um dos autores (KZ) foi introduzido pela primeira vez para viver dissecção mais de 20 anos atrás por Nipam Patel, que era então um estudante graduado em laboratório Corey Goodman. Em anos mais recentes, foi utilizado este método para manchar o SNC, com anti-Fas3 [2], mas dissecções empregados fixos para todos os outros experimentos. Em 1999, Aloisia Schmid, em seguida, um pós-doc no nosso grupo, apresentou-nos a viver dissecção com agulhas de vidro, que ela usava para examinar fenótipos em cadeia dupla RNA injetado embriões [3, 4]. Quando começamos a fazer o ligante RPTP telas alguns anos mais tarde, nós modificamos a protocolos para permitir a análise rápida de grandes coleções de reservas mantidas ao longo GFP balanceadores. Descobrimos que GFP-negativos embriões podem ser facilmente classificados de GFP-equilibrada ações, mesmo quando há expressão GFP substancial materna (por exemplo, o balanceador de TM3armGFP), porque os embriões são classificados diferenças ao vivo e sutil na expressão de GFP pode ser facilmente detectado. Df nossa tela de sucesso para um ligante Lar é descrito em [5].

Usando nosso protocolos atuais, um único indivíduo treinado pode tela linhas 50-10 por dia para fenótipos, examinando 4-7 embriões mutantes de cada linha em um microscópio composto. Depois de selecionar e arraying os embriões, que leva cerca de uma hora para dissecar 50 embriões. Este método permite-nos identificar mutações que lhe confiram sutil, de baixa penetraçãonce fenótipos, uma vez que até 70 hemisegments por linha são marcados em grandes ampliações com uma lente de imersão em água 40X. Esses fenótipos seriam difíceis ou impossíveis de serem detectadas nas telas de todo manchado mount-embriões sob um microscópio de dissecação.

Nós definimos um kit para triagem fenotípica Df que contém cerca de 250 linhas e representa cerca de metade do genoma (AW et al., Em preparação). O desenvolvimento deste kit foi iniciado como parte de nossa tela do Df Bloomington kit tal como existia em 2002-2003 para os genes necessários para a síntese RPTP ligante [5]. No decorrer desta tela, substituímos Bloomington kit DFS para o qual Df / Df homozigotos não desenvolver um sistema nervoso central (e, portanto, não poderiam ser selecionados para CNS expressão ligante) com menor DFS, de preferência molecularmente mapeado, que tiveram melhor desenvolvimento.

Df / Df homozigotos a partir de linhas em nosso kit de triagem fenotípica têm morfologias normais geral na fase 16, permitindo que um investigador para a tela de forma sistemática para genes que afetam o desenvolvimento do SNC, o PNS, as fibras musculares, a rede traqueal, e muitos outros tecidos. Qualquer estrutura, padrão de expressão, ou padrão de localização subcelular que é visualizável com um anticorpo específico ou marcador GFP em estágios 14-16 podem ser selecionados para fenótipos usar este kit. Isto significa que, utilizando o protocolo descrito aqui, uma pessoa gastar cerca de metade de sua / seu tempo neste projeto poderia sistematicamente tela metade de todos os genes da drosófila para qualquer fenótipo desejado embrionárias dentro de seis meses a um ano.

A. de colheita de embriões Drosophila

1. Prepare "Five-Barrel" câmaras de coleta de ovos

Estas câmaras economizar tempo e esforço ao examinar um grande número de linhas de voar.

1. Organizar cinco 50mL tubos cônicos de cabeça para baixo em uma parte inferior de um prato 100 15 mm x Petri de plástico e cola os tubos em conjunto, utilizando silicone selante adesivo de borracha.
2. Depois que a cola é endurecido, cola a parte de baixo da placa de Petri sobre as extremidades dos tubos cônicos. Cinco tubos cônicos vai ficar dentro da placa de Petri.
3. Usando uma agulha quente, fazer furos nos tubos para circulação do ar.

2. Prepare pratos de coleta de ovos

1. Despeje sobre 7ml de gel de agar de uva (1%) em cada 100 mm x 15 prato de Petri de plástico. A espessura ideal do gel é de cerca de 3-4 mm para selar cada tubo cônico e fornecer a hidratação por 24 horas. Se o gel é muito grosso, pode cair quando mudamos a placa.
2. Depois de esfriar as placas de gel, tampa e colocar esses sacos no original prato de plástico Petri. Feche o saco com força e armazenar a 4 ° C.

3. Prepare moscas

1. A fim de obter ovos suficientes para facilitar a seleção de embriões do estágio correto, nós tentamos colocar> 50 virgens em uma cruz, junto com> 20 machos.
2. Se a cruz é para ser exibido, misture as moscas macho e fêmea e se manter em um frasco de alimentos voar com lotes de pellets levedura seca na parte inferior e uma tira de papel fino (10 X 100 mm, dobrado ao meio) plantado no meio da a comida. A tira de papel irá proporcionar mais área de superfície e manter as moscas de umidade excessiva.
3. Mantenha os frascos com as moscas à temperatura por pelo menos 3 dias.
4. Se a ação de uma garrafa deve ser blindado, simplesmente transferir voa para dentro da câmara de coleta.

4. Transferência voa para o barril de cinco câmaras de coleta de ovos.

1. Rótulo do barril de câmaras de cada coleta de ovos.
2. Coloque o fermento em colar uma placa de coleta de ovos para cada barril.
3. Prepare 20 fita rotulagem polegada de comprimento para manter a câmara ea placa juntos. Dobre 10 mm de cada extremidade para a mudança da placa fácil.
4. Injectar gás CO ₂ nos frascos voar e transferência das moscas nos tambores rotulados.
5. Cobrir a câmara com a placa de coleta de ovos e pressione para baixo.
6. Fita ao redor da câmara e da placa em conjunto a partir do meio da placa de ágar. A fita vai sobrepor-se, a chapa de coleta de ovos.

5. Coletar embriões

1. Prepare placa de coleta de ovos: Coloque o fermento em colar uma placa de coleta de ovos para cada barril.
2. Toque para baixo as moscas em câmaras de coleta de ovos e retire a fita em volta das câmaras (Segure a placa velha com força).
3. Toque para baixo as moscas novamente e substituir a placa velha por uma nova.
4. Coletar embriões em posição inclinada para 2-4 horas.
5. Substituir a placa de coleta de ovos no tempo desejado.

6. Embriões idade

Coloque a placa de coleta de ovos de cabeça para baixo em uma placa de Petri cobertas com papel molhado círculo filtro de 90 milímetros e manter na temperatura desejada. Para dissecção de estágio de 16 embriões de linhagens mutantes equilibrada, que normalmente fazem uma coleção no final da manhã, então incubar os embriões parar> 22 horas a 19 ° C. Para o ganho de função estudos utilizando o sistema UAS/GAL4, coletamos embriões na RT no período da tarde e incubar por 16 horas a 19 ° C. No dia seguinte, a transferência dos embriões para uma incubadora de 29 ° C para ativar o sistema UAS/GAL4 para 1 ou 2 hr. Após este período de tempo, os embriões são na sua maioria estágio 15, e isso permite tempo suficiente para classificar embriões de expressão GFP e alinhá-las, de modo que eles vão estar em palco 16 anos quando a dissecção é feita.

7. Estadiamento e classificação de embriões para a expressão GFP.

Para discriminar os genótipos de embriões, nós usamos GFP balanceadores. Examinamos embriões dechorionated em dupla-pau de fita (veja a próxima seção), sob um GFP Olympus dissecar âmbito, e selecioná-los para a idade e expressão GFP ao mesmo tempo.

a) GFP classificação:

1. O balanceador de cromossomo 2 que nós usamos (CyOarmGFP) tem GFP conduzido pelo promotor de tatu, que se expressa em todo o ectoderma. Heterozigotos CyOarmGFP são verde-oliva, e homozigotos CyOarmGFP são verdes brilhantes. Em um estoque CyoarmGFP, os embriões que não têm o balanceador são facilmente distinguidos porque têm quase nenhuma expressão GFP (eles se parecem com embriões a partir de um estoque sem balanceador de GFP).
2. O balanceador de cromossomo 3 (TM3armGFP) é mais difícil de usar para classificar, porque tem mais expressão GFP maternalmente conduzido. Como resultado, os embriões são divididas em categorias mais e menos verde. Com alguma prática, é geralmente simples para classificar os embriões menos e mais verde do outro, mas também é necessário recorrer-los por agrupamento deles e escolhendo os embriões ocasionais que são mais verdes do que os outros (heterozigotos TM3armGFP) após a transferência para a placa de ágar. Caso contrário, há a certeza de ser alguns embriões que são do genótipo incorreta.
3. O balanceador de X é FM7 Kr-GAL4, UAS-GFP. Isto é expresso em um padrão de tecido específico. Os padrões que são relevantes para a classificação em estágios 15-16 são os amnioserosa e dois pontos de expressão na cabeça, que são as células do Bolwig do órgão. Infelizmente, na fase em que se quer para classificar embriões, o amnioserosa está desaparecendo e órgãos do Bolwig de ainda não começaram a brilhar. Assim, é necessário olhar com muito cuidado para os embriões na fita, muitas vezes rolling-los, para marcar-los para GFP, e é essencial para recorrer-los na placa de agar. Normalmente fazemos isso duas vezes: uma logo após a movimentação de todos os embriões a partir da fita à placa, e novamente após o envelhecimento para o palco apropriado, pouco antes de alinhá-los na preparação para dissecção. Às vezes, também re-examinar o slide no âmbito GFP após a transferência dos embriões para a piscina PBS (veja abaixo), porque a visualização de GFP é melhor nessas condições. Então, podemos destruir embriões que têm GFP apenas antes do início da dissecção.

b) Staging

A principal ferramenta para o estadiamento de embriões em torno de st. 14-16 é a morfologia intestinal. O intestino brilha com autofluorescência no âmbito GFP. Antes de tentar embriões em estágio, deve-se consultar livros de referência ou sites que tenham fotos e diagramas de embriões (por exemplo, o Hartenstein e Campos-Ortega livro verde), de modo que se compreende o que deve ser parecida. O palco ideal para dissecção é quando o intestino tem dividido em três faixas. Antes disso, o intestino aparece como uma massa única. Muitas vezes os tipos embriões na fase blob e idades-los até que atinjam a melhor fase para dissecção. Após o estágio de três bandas, o intestino começa a desenvolver bandas diagonal perto da cauda, ​​e depois bobinas, eo embrião se torna mais clara. Dentro deste período, o embrião torna-se difícil para dissecar porque não vai ficar para a lâmina de vidro. Se alguém quiser dissecar fase tardia 16/early estágio 17 embriões, é necessário dissecar muitos embriões e avaliar quais morfologias intestino estão associados com os embriões que furam ou não furar. Isso varia um pouco entre os genótipos também.

B. dissecção embrião de Drosophila ao vivo

1. Dechorionation embrião
   1. Prepare fita dupla face adesiva e laje placa de uva em um slide
   2. Transferência dos embriões com idade a partir da placa de coleta para a fita adesiva dupla-face usando um pincel molhado. Espalhe uniformemente embriões.
   3. Dechorionate os embriões na fita adesiva dupla face, rolando-os em todo-o suavemente com uma agulha de dissecação embotados. Depois dechorionation, os embriões vai ficar mais forte até o fim da agulha do que para outros embriões ou para o córion, mas não tão forte como a fita, assim rola um dos embriões em cima do córion ou em outros embriões, então elevadores -lo e transfere para a laje de placa de uva. Genotipagem e estadiamento (veja acima para uma descrição detalhada) é feito durante o processo de dechorionation etransferência para a agulha.
   4. Depois de recorrer para o genótipo e idade, mover os embriões a um menor laje retangular de agar, de largura suficiente para permitir a fila de 10-15 embriões em uma fileira. Alinhar os embriões dechorionated nesta laje: lado dorsal para baixo contra as extremidades agar laje e posterior voltada para você. Que normalmente fazem linhas de embriões 5-10.
2. Preparar um slide e transferência de embriões para dissecção ao vivo
   1. Corte um pequeno pedaço retangular de fita dupla face adesiva e coloque-o perto de um final de Super deslize Frost / Plus (Fisher Scientific, Cat # 12-550-15).
   2. Desenhe um retângulo (30-40 mm de comprimento, e toda a largura do slide) em torno da fita com uma caneta de cera, para que haja ~ 3 mm de espaço entre a cera e fita (Super Pen Pap HT, www.rpicorp. com ) e transferência de embriões a partir da laje de placa de uva para a fita, por deslize a inversão e delicadamente abaixar-lo para os embriões, de modo que a fita entra em contato com os embriões alinhados (feito sob um escopo dissecar). Os embriões devem ser alinhadas de modo que a extremidade posterior é para você. Eles agora serão acima do lado dorsal no slide.
   3. Imediatamente adicionar 1X PBS (receita Gibco) sobre os embriões para preencher o retângulo de cera.
3. Dissecção embrião vivo
   1. Usando uma agulha de dissecação de vidro (feito a partir de uma agulha de injeção), corte ao longo da linha média dorsal, a partir da extremidade posterior do embrião.
   2. Poke a extremidade anterior do embrião, levante e transferência do embrião para o slide até que fura. Manter embriões no buffer. Faça uma linha ordenada de embriões no slide que corresponde cada linha na laje agar. Organize as linhas para que elas cabem no slide.
   3. Há uma variedade de seqüências de dissecção possível que pode ser usado na geração de filetes. As pessoas desenvolvem seus próprios procedimentos otimizados através fazendo as dissecações si. O vídeo demonstra uma seqüência em que um pequeno corte é feito na extremidade posterior do embrião para separar os dois lados da parede do corpo um do outro. Se desejar, também se pode quebrar a ligação do intestino médio / hindgut com este corte, e deslocar o intestino posterior para fora para o slide neste momento (no vídeo, o deslocamento é feito hindgut mais tarde). Depois, os cortes são feitos em cada lado apenas posterior aos lobos do cérebro a fim de separar as paredes do corpo do cérebro. Dependendo da idade do embrião, pode-se também precisará fazer um corte raso para baixo da linha média dorsal para cortar a conexão entre as paredes amnioserosal corpo.
   4. Então, gentilmente colar as abas da parede do corpo para o slide, evitando esticá-los ou retirar material de sua superfície. Este é o melhor feito por apenas permitindo que a agulha entrar em contato com os cantos anterior e posterior nas bordas dorsal da parede do corpo. Os axônios motores não se estendem até aqui dorsalmente, assim, no melhor dos casos isto irá produzir um embrião com ramos ISN completamente intacto. Em alguns casos, o ISN vai ser truncado, mesmo com a melhor técnica, porque o embrião nem sempre separadas exatamente ao longo da linha média dorsal. Se feito corretamente, esse método irá preservar as estruturas parede do corpo em segmentos T3-A6 (aproximadamente).
   5. Pode-se deixar o intestino médio em cima do embrião, e depois removê-lo de todos os embriões dissecados depois de terminar todas as dissecções. Isso é feito por cutucando o gut, deslocando-a do embrião, e esticá-lo para quebrar a sua ligação ao intestino anterior, que se encontra sob os lóbulos cerebrais. Ou, pode-se remover o intestino de cada um como dissecção completa. Com mutantes que ter um desenvolvimento anormal do intestino, é uma vantagem para remover todas as entranhas de uma vez depois de terminar a dissecções, porque a gema liberada a partir do intestino pode tornar mais difícil de manter embriões posteriormente transferidos para o slide após a transferência da fita doublestick . Às vezes é útil para transferir os embriões começando na parte inferior do slide (para você) e não no topo, como gema tende a se espalhar em direção a você, devido aos movimentos típicos da agulha.
4. Fixação e de imunofluorescência / imuno-histoquímica
   1. Neste ponto, um pode corrigir os embriões imediatamente, se houver uma coloração com anticorpos, ou pode-se remover o PBS e substituí-lo com sobrenadante proteína de fusão, se alguém está fazendo um experimento de coloração ao vivo para detectar a expressão do ligante. Este aspecto do experimento é descrito em detalhes nos métodos e seções Métodos Suplementares de ref. [5].
   2. Aqui nós descrevemos o protocolo de fixação, que é feito imediatamente ou após coloração proteína de fusão. Usando duas pipetas Pasteur, substituir o PBS com paraformaldeído 5% em PBS (EMS, Cat. # 15713-S, www.emsdiasum.com). Troca em solução corrigir três vezes, o que envolve o uso de ~ 6 ml de solução de corrigir, já que uma pipeta Pasteur detém1,5-2 ml de solução. Correção para 45 '.
   3. Remover corrigir solução, substitua com PBS (3 mudanças), em seguida, com PBT (PBS + 0,1% Triton X-100 + 1 mg / ml Fraction V BSA; 3 mudanças), e depois substitua PBT com ~ 200 mL de solução de bloco (PBT + 5 tratados termicamente% de soro normal de cabra), depois com o anticorpo primário desejado em solução de bloco. É muito importante para não permitir que o menisco entrar em contato com os embriões, especialmente enquanto eles estão em PBS, pois isso irá destruir a dissecações. Depois de detergente é adicionado os embriões tornam-se menos sensível ao menisco. Assim, pode-se substituir o PBT com bloqueio por derrubar o slide e blotting a maior parte da solução tocando em um Kimwipe brevemente para o canto da área delimitada pela cera. O mesmo método pode ser usado para substituir o bloco com uma solução anti corpo. Esta transição minimiza das soluções.
   4. Incubar overnight a 4 ° C, em seguida, lave 3X com PBT (> 15 minutos de lavagem /) em uma bandeja em uma plataforma de balanço (certifique-se há bastante PBT para que o slide é sempre completamente imerso durante balanço), reblock como descrito acima, adicionar 200 mL de anticorpo secundário, incubar por 2 horas. na RT, rewash com PBT. Verifique a coloração (se fluorescência verde é usado), se desejar sob o GFP dissecar escopo.
   5. Lave 2X com PBS (5 '), em seguida, adicionar 500 mL de 70% glycerol/1X PBS (feito através da mistura de 35 ml de glicerol, 5 ml de PBS 10X, e 10 ml de água em um tubo de 50 ml), e claro durante a noite a 4 ° C (ou por 2 horas a RT). Remover o glicerol e colocar em um # 1 lamela.

Discussão

Desejamos que este vídeo de demonstração tem apresentado os nossos métodos para dissecção embrião vivo e coloração em detalhes suficientes para que eles agora podem ser facilmente executados por qualquer pessoa que tenha alguma experiência em Drosophila genética e da embriologia. É claro, a prática ainda será necessário, principalmente para as dissecações si. Em nossa experiência, cada pessoa que aprende os métodos de dissecação ao vivo irá criar um protocolo de dissecação sutilmente dif...

Materiais

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