ジ- 8 - ANEPPSで誘起膜電位の測定

要約

外部電界が細胞の膜上に電圧を誘導する、誘起膜電位は（ΔΦ）と呼ばれる。電位差染料ジ- 8 - ANEPPSを使用して、それは非侵襲的にΔΦを測定することが可能です。このビデオは、di - 8 - ANEPPSを使用してΔΦを測定するためのプロトコルを示しています。

要約

外部電場にセルの配置は、膜を通過する電圧で、その結果、細胞膜の近傍に細胞の局所電荷の再分配の内側と外側を引き起こします。この電圧は、誘起膜電位（も誘導される膜貫通電圧、または誘導膜電位の差）と呼ばれるとΔΦで表されるが、唯一の外部磁界が存在する限り存在する。安静時の電圧が膜上に存在する場合、誘起電圧は、その上に（追加）重ね書きします。例えばジ- 8 - ANEPPSとして電位差蛍光色素、のいずれかを使用して、それは細胞膜上にΔΦの変動を観察し、非侵襲的にその値を測定することが可能です。 ΔΦの変化に比例した蛍光強度の変化と、細胞膜の脂質二重層に結合するとジ- 8 - ANEPPSは、強い蛍光となります。このビデオでは、測定するためのプロトコルΔΦ用いたジ- 8 - ANEPPSを示し、また、振幅とΔΦの空間分布に及ぼすセル形状の影響を示しています。

プロトコル

パートI：予備的な手順

1. この実験ではチャイニーズハムスター卵巣細胞株（CHO - K1）が使用されます。細胞は8％ウシ胎児血清を添加したHAM - F12培地中で〜0.7x10 ⁵細胞/ ml、0.15 mg / mlの時のLab - Tek社IIチャンバー（2ウェルを、4cm ^2のそれぞれ）（Nalge Nunc社、ドイツ）でメッキされていますL -グルタミン、16 mg / mlのゲンタマイシン（Sigma - Aldrich社、シュタインハイム、ドイツからのすべて）、および200ユニット/ mlのCrystacillin（Pliva、ザグレブ、クロアチア）、および37℃、5％CO ₂でインキュベート℃のまた、細胞はまた、ポリリジンなどの細胞接着剤を塗布＃1ガラスカバースリップ（厚さ0.13〜0.16ミリメートル）、にめっきすることができる。
2. それらの培地で細胞をインキュベートする。それでもほぼ球形であるが、しっかりとそれらの膜の小さな部分と表面に付着した2〜4時間の収量細胞続くインキュベーション。また、インキュベーションの16〜20時間後、細胞は完全に表面に付着し、より複雑な形を持っているが、それらのほとんどは、まだ割っていませんされています。
3. 元インビトロジェンバイアル中の染料の5mgにDMSOの843μL（シグマ - アルドリッチ、シュタインハイム、ドイツ）を追加することにより、ジ- 8 - ANEPPS（Invitrogen社、ユージン、オレゴン州、米国）の10 mMのストック溶液を調製。ストック溶液は、数ヶ月間、4℃の冷蔵庫に保管することができます。 DMSOの結晶が溶解するまで実験を開始する前に、ソリューションのウォームアップを行います。
4. いくつかの細胞株は、細胞膜への色素の取り込みを容易にするために、プルロニックの使用が必要になる場合があります。プルロニックは、20％DMSO（F - 127、Invitrogen社、ユージン、オレゴン州、米国）のストック溶液、またはDMSO中でプルロニックを溶解して調製することができる、同じ濃度のストック溶液で購入することができます。プルロニックのストック溶液を室温で保存することができます。

パートII：ジ- 8 - ANEPPSを細胞にロード

1. 10mMのジ- 8 - ANEPPSと最小必須培地のSMEMのスピナーの変更（カルシウム枯渇版）（ミディアムM8167またはM4767、Sigma - Aldrichは、シュタインハイム、ドイツの1 mlの20％プルロニック2.5μlの3μlを混ぜて1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに）。これは約30μMジ- 8 - ANEPPSとプルロニックの0.05％を含む"ローディングソリューション"を得られます。他の細胞型の場合は、それらのネイティブの培養培地は、SMEMの代わりに使用できます。
2. ローディング溶液でのLab - Tek社チャンバー内の培養液を交換してください。 4℃で10分間冷蔵庫にチャンバーを転送℃にこの温度で​​は、形質膜を介して色素のインターナリゼーションが大きく阻害される。
3. 染色後、優しく純粋なSMEMに過剰な色素を2〜3回洗浄する。
4. チャンバー内のSMEM 1.5mlを残す。

パートIII：実験と画像取得

1. 細胞は、油浸対物レンズ（X63、NA 1.4）、モノクロ（ポリクロームIV、Visitron、ドイツ）と冷却CCDカメラ（VisiCamを装備した蛍光顕微鏡を（我々の場合ツァイスAxioVert 200、ツァイス、ドイツ）を用いて観察される1280年、Visitron、ドイツ）。画像はMetaFluor 7.1.1で買収し、MetaMorph 7.1.1（両方Molecular Devices社、ダウニングタウン、ペンシルバニア州、米国）で処理されますが、他の同じような買収のソフトウェアも使用することができますされています。 490nmでの集録ソフトウェアの励起波長を設定し、例えばANEPPSに適した発光フィルター、605 nmの中心のバンドパスフィルタを（605/55m、ダイクロイック565 DCXR、クロマ、ロッキンガム、バーモント州、米国）を選択します。モノクロメータが使用できない場合は、490 nmの中心の励起フィルターを代わりに使用することができます。
2. 顕微鏡ステージ上に細胞をチャンバーを置く、チャンバーの下部に電極を配置し、パルス発生器に接続します。培地には、電極をカバーする必要があります。
3. 細胞の生存を維持し、発熱を低減するために、パルスが十分に低い振幅と持続時間が短いはずです。この実験では35 V振幅と50 msの持続時間（エレクトロポレーションを防ぐのに十分な低さ）の方形パルスは直流電圧の供給とカスタムメイドのマイクロプロセッサー制御のスイッチャーのデバイスを使用して生成されます。また、そのようなS88（グラス、ウェストワーウィ​​ック、ロードアイランド、米国）などのアンプや商業刺激装置に接続されている33210A（アジレント、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）などの商業パルスジェネレータは、、、使用することができます。パルスは、電極と誘導ΔΦの間に約88 V / cmの電場を作る、0.8mmの直径とそれらの間に4 mmの距離で2つの並列のPt / Irのワイヤ電極に配信されます。この実験で使用される電極間の正確な電界分布が他の場所[1]に記載されています。
4. 目的の細胞を見つける。単一の電気パルスまたはパルスのシーケンスを適用します。すぐにパルス（制御画像）1つ前とパルス（パルスの画像）中に1つ：各パルスの場合は、二つの蛍光画像を取得。ジ- 8 - ANEPPSの低い応答のために、蛍光の変化は、肉眼で識別し、明らかにONLになることは困難である処理の後にyを。パルスの配信は、買収のソフトウェアの特徴である画像取得、と同期する必要があります。加熱を退色し、可能な回避するために、照明は、パルスの持続時間に制限することができます。

第IV部：画像処理と解析

1. MetaMorphソフトで画像を開きます。各パルスの場合、制御とパルスのイメージの両方でバックグラウンドを引く。
2. セルを選択し、それが膜に対応するように関心領域を設定します。制御とパルス画像内のこの領域に沿って蛍光強度を測定し、スプレッドシートに値を転送する。
3. 各パルスは、パルスデータから制御データを減算し、相対的な蛍光の変化を得るための制御データで結果を割ります。パルスシーケンスが適用されている場合は、各パルスに決定相対的な蛍光の変化の値は、より信頼性の高い測定を得るために平均化することができます。
4. 検量線を使用してΔΦに相対的な蛍光の変化を変換します。この曲線の大まかな推定は、文献から得たものですが、より高い精度のために、それはそれぞれ特定のセットアップのために測定する必要がありますすることができます。細胞と本実験で使用したセットアップのために蛍光で6％の減少は、ΔΦ[2]で100 mVの増加に対応しています。
5. 最後に、このようなエクセル（マイクロソフト社、レドモンド、ワシントン州、米国）、シグマプロット（SYSTAT Software社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）などのグラフィック系ソフトウェアパッケージの相対的な弧の長さの関数として電圧をプロットする、または原点（OriginLabの（株）、ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国）。曲線はまた、移動平均フィルタのような適切なフィルターを用いて平滑化することができます。

ディスカッション

誘導膜（膜貫通）電圧、ΔΦ、の測定値は、電位依存性膜チャネル、活動電位の伝播、心筋細胞の刺激、または細胞膜のエレクトロポレーション[3、4、5、6の研究など、様々な実験の設定、に重要になることがあります、7]。単純細胞の形状で、ΔΦ解析的に計算することができます。例えば、球状の細胞のために、ΔΦは、電圧が電界強度とセルのサイズに比例であることを示すと膜に沿って余弦関数を次シュの方程式、で与えられる[8、9]。より複雑な細胞の形状の場合は、ΔΦ余弦から大幅に逸脱することができ、電位差染料[12、13、14、15]を使用して、[2、10、11]、または実験的にコンピュータを使用して、どちらかの数値的に決定する必要があります。

広くこの目的で使用される電位差染料の一つは、ジ- 8 - ANEPPS（ジ- 8 -ブチル - アミノ-ナフチル-ピリジニウム-プロピルスルホン酸エチレン）、励起と発光の膜電位に依存するスペクトルを持つ高速な色素であり、その細胞膜上にΔΦのバリエーションの非侵襲的観察を可能にし、その値を測定する。このビデオでは、我々は、ジ- 8 - ANEPPSを使用して、ΔΦの決定のための実験的なアプローチを示しています。

染料は、コネチカット大学の教授レスリーロウズら[13、14]によって開発され、高速応答色素のクラスに属していた。ジ- 8 - ANEPPSは水に非蛍光であり、それは細胞膜の脂質二重層に組み込まれてときに強く蛍光性になる。分子内電荷分布と色素の蛍光のスペクトルプロファイルと強度の対応する変化の変化ΔΦの結果の変化。ジ- 8 - ANEPPSの蛍光強度は、ΔΦの変化に比例して変化する。色素の反応は、-280 mVから250までmVの[4、16]電圧に対して線形である。このような努力にも[17]が報告されたが染料、不均一な膜染色の蛍光は比較的小さな変化、および染料内在化は、膜電位、例えば、その休憩成分の絶対測定のためのジ- 8 - ANEPPSはあまり適していません。それは、しかしながら、そのような興奮性細胞[4,5]で外部電界にさ​​らされる非興奮性の細胞の誘導膜電位の発症[12、13]、または活動電位のような膜電位の大きな変化を、測定に適しています。ここで適用されていないものの、ジ- 8 - ANEPPSも[18]または応答の感度を増加させると上記の効果を軽減発光[19]、蛍光励起のレシオメトリック測定によりΔΦの決定を可能にする。ジ- 8 - ANEPPSの汚れ膜として、それはまた、細胞膜マーカー[2]としてはっきりと使用することができます。

染料の欠点の一つは、それが退色する傾向があることですので、強い光に長時間暴露は避けるべきであること。染料のキャリブレーションは、外部媒体のいずれか（I）カリウムイオノフォアバリノマイシンと異なるカリウム濃度のセットで実行される[2,18]、または（ii）パッチクランプ電圧クランプモードで[17]。

最後に、より複雑な形状の球状の細胞と細胞のΔΦの測定と、ビデオは、セルの振幅の図形とΔΦの空間分布の影響を示しています。したがって、球状の細胞のためのΔΦより複雑な細胞の形状のためにΔΦの空間分布がより複雑である一方、シュヴァン方程式との合意で、コサインに近い[20] ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
di-8-ANEPPS	Invitrogen	D-3167	potentiometric fluorescent dye
pluronic	Invitrogen	P3000MP	potassium ionophore
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
SMEM	Sigma-Aldrich	M8167 or M4767	Spinner modification of the Minimum Essential Medium
Ham-F12	Sigma-Aldrich	N4888	culture medium
fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Lab-Tek II	Nalge Nunc international	155379	chamber
DC voltage supply	Elektro-Automatik
microprocessor-controlled switcher	Custom Made
electrodes	Custom Made		Pt/Ir