Mesurer la tension de membrane induite avec Di-8-ANEPPS

Résumé

Champ électrique externe induit une tension sur la membrane d'une cellule, appelée tension de membrane induite (ΔΦ). En utilisant le colorant potentiométrique di-8-ANEPPS, il est possible de mesurer la ΔΦ non invasive. Cette vidéo montre le protocole de mesure de ΔΦ utilisant di-8-ANEPPS.

Résumé

Placement d'une cellule dans un champ électrique externe provoque un intérieur frais locaux de redistribution et à l'extérieur de la cellule dans le voisinage de la membrane cellulaire, résultant en une tension à travers la membrane. Cette tension, appelée tension de la membrane induite (tension transmembranaire a également induit, ou induite différence de potentiel transmembranaire) et désigné par ΔΦ, n'existe que tant que le champ extérieur est présent. Si la tension au repos est présent sur la membrane, la tension induite superpose (ADDS) sur elle. En utilisant l'un des colorants fluorescents potentiométrique, tels que le di-8-ANEPPS, il est possible d'observer les variations de ΔΦ sur la membrane cellulaire et de mesurer sa valeur non invasive. di-8-ANEPPS devient fortement fluorescent lorsqu'il est lié à la bicouche lipidique de la membrane cellulaire, avec le changement de l'intensité de fluorescence proportionnelle à la variation des ΔΦ. Cette vidéo montre le protocole de mesure de ΔΦ utilisant di-8-ANEPPS et démontre aussi l'influence de la forme des cellules sur l'amplitude et la répartition spatiale des ΔΦ.

Protocole

Partie I: Les étapes préliminaires

1. Dans cette expérience chinoise en ligne de hamster cellules ovariennes (CHO-K1) est utilisé. Les cellules sont étalées dans le Lab-Tek II chambres (2 puits, 4 cm ² chacun) (Nalge Nunc, Allemagne) à ~ 0.7x10 ⁵ cellules / ml dans HAM-F12 milieu de culture supplémenté avec 8% sérum de veau foetal, 0,15 mg / ml L-glutamine, 16 mg / ml de gentamicine (tous de Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne), et 200 unités / ml Crystacillin (Pliva, Zagreb, Croatie), et incubés dans 5% de CO ₂ à 37 ° C. Alternativement, les cellules peuvent également être plaqués sur le n ° 1 des lamelles de verre (0,13 à 0,16 mm d'épaisseur), enduit d'un adhésif cellulaires tels que la polylysine.
2. Incuber les cellules dans leur milieu de culture. L'incubation dure de 2 à 4 heures rendements des cellules qui sont encore à peu près sphérique, mais fermement attaché à la surface avec une petite partie de leur membrane. Sinon, après 16 à 20 heures d'incubation, les cellules sont totalement attachés à la surface et ont des formes plus complexes, mais la plupart d'entre eux ne sont toujours pas se diviser.
3. Préparer une solution stock de 10 mM de di-8-ANEPPS (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) en ajoutant 843 ul de DMSO (Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne) à 5 mg de colorant dans le flacon d'origine Invitrogen. La solution mère peut être stockée dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant plusieurs mois. Avant de commencer les expériences, réchauffer la solution jusqu'à ce que les cristaux du DMSO de se dissoudre.
4. Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter l'utilisation de pluronic pour faciliter l'incorporation du colorant dans la membrane cellulaire. Pluronic peut être acheté dans une solution stock de 20% dans le DMSO (F-127, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA), ou une solution stock de la même concentration peut être préparée en dissolvant pluronique dans le DMSO. Solution mère de Pluronic peut être conservé à température ambiante.

Partie II: Chargement des cellules avec des di-8-ANEPPS

1. Mélanger 3 ul de 10 mM di-8-ANEPPS et 2,5 l de pluronic 20% dans 1 ml de la modification Spinner (calcium appauvri version) de l'SMEM milieu essentiel minimum (moyenne M8167 ou M4767, Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne ) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Cela donne une «solution de chargement", contenant environ 30 uM di-8-ANEPPS et 0,05% de pluronic. Pour d'autres types cellulaires, leurs milieux de culture indigène peut être utilisé au lieu du SMEM.
2. Remplacez le milieu de culture dans la chambre de Lab-Tek avec la solution de chargement. Transfert de la chambre au réfrigérateur pendant 10 min à 4 ° C. A cette température, l'internalisation du colorant à travers la membrane plasmique est largement inhibée.
3. Après coloration, laver délicatement l'excès de colorant deux à trois fois avec des SMEM pur.
4. Laisser 1,5 ml de SMEM dans la chambre.

Partie III: Expérimentation et d'acquisition d'image

1. Les cellules sont observées en utilisant un microscope à fluorescence (dans notre cas Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Allemagne) équipé d'un objectif à immersion (x63, NA 1,4), un VisiCam monochromateur (Polychrome IV, Visitron, Allemagne) et une caméra CCD refroidie ( 1280, Visitron, Allemagne). Les images sont acquises avec MetaFluor 7.1.1 et traitées dans MetaMorph 7.1.1 (deux Molecular Devices, Downingtown, PA, USA), mais d'autres logiciels d'acquisition similaire peut également être utilisé. Régler la longueur d'onde d'excitation dans le logiciel d'acquisition à 490 nm et de choisir un filtre d'émission approprié pour ANEPPS, par exemple, un filtre passe-bande centré à 605 nm (605/55m, dichroïque 565 DCXR, Chroma, Rockingham, Vermont, USA). Si un monochromateur n'est pas disponible, un filtre d'excitation centrée à 490 nm peut être utilisée à la place.
2. Placez la chambre avec des cellules sur la scène microscope, la position des électrodes dans le bas de la chambre et les connecter au générateur d'impulsions. Le milieu doit recouvrir les électrodes.
3. Afin de maintenir la viabilité cellulaire et de réduire le chauffage, l'impulsion doit être d'amplitude suffisamment faible et de courte durée. Dans cette expérience, une impulsion carrée avec 35 V d'amplitude et de 50 ms (assez bas pour éviter l'électroporation) est généré en utilisant une alimentation en tension DC et une sur-mesure à microprocesseur dispositif de commutation. Alternativement, un générateur d'impulsions commerciales, telles que 33210A (Agilent, Santa Clara, CA, USA) relié à un amplificateur ou un stimulateur commerciaux, tels que S88 (Grass, West Warwick, Rhode Island, USA), peuvent être utilisés. L'impulsion est délivrée à deux parallèles électrodes en fil de Pt / Ir de 0,8 mm de diamètre et 4 mm de distance entre eux, créant un champ électrique d'environ 88 V / cm entre les électrodes et ΔΦ inducteur. La distribution du champ exact entre les électrodes utilisées dans cette expérience est décrite par ailleurs [1].
4. Trouver les cellules d'intérêt. Appliquer une seule impulsion électrique ou une séquence d'impulsions. Pour chaque impulsion, l'acquisition de deux images de fluorescence: un immédiatement avant que l'impulsion (l'image de contrôle), et un cours de l'impulsion (l'image d'impulsion). En raison de la faible réponse du di-8-ANEPPS, les changements dans la fluorescence sont difficiles à discerner à l'œil nu et deviennent apparents ONLY après traitement. La livraison d'impulsion doit être synchronisé avec l'acquisition de l'image, qui est une caractéristique du logiciel d'acquisition. Pour éviter de photoblanchiment et possible de chauffage, l'éclairage peut être limitée à la durée de l'impulsion.

Partie IV: traitement et analyse d'images

1. Ouvrez les images dans le logiciel MetaMorph. Pour chaque impulsion, il faut soustraire le fond à la fois dans le contrôle et l'image de pouls.
2. Choisissez une cellule et définir la région d'intérêt afin qu'elle corresponde à la membrane. Mesurer les intensités de fluorescence le long de cette région dans l'image de contrôle et d'impulsion et de transférer les valeurs vers un tableur.
3. Pour chaque impulsion, il faut soustraire les données de contrôle à partir des données d'impulsion, et divisez le résultat par des données de contrôle pour obtenir les changements relatifs à fluorescence. Si une séquence d'impulsions est appliqué, les valeurs de relative changements de fluorescence déterminés pour chaque impulsion peut être calculée pour obtenir une mesure plus fiable.
4. Transformer les changements relatifs à fluorescence en utilisant un ΔΦ courbe de calibration. Une estimation approximative de cette courbe peut être obtenu à partir de la littérature, mais pour une plus grande précision, elle doit être mesurée pour chaque installation particulière. Pour les cellules et la configuration utilisés dans cette expérience une baisse de 6% de la fluorescence correspond à une augmentation de 100 mV dans ΔΦ [2].
5. Enfin, l'intrigue de la tension en fonction de la longueur d'arc relative dans un logiciel graphique comme Excel (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA), Terrain de Sigma (Systat Software Inc, San Jose, CA, USA), ou Origine (OriginLab Corp, Northampton, MA, USA). La courbe peut aussi être lissé à l'aide d'un filtre approprié, tel que le filtre moyenne mobile.

Discussion

Mesures de la membrane induite (transmembranaire) de tension, ΔΦ, peut être important dans divers contextes expérimentaux, tels que les études des canaux membranaires voltage-dépendants, la propagation du potentiel d'action, la stimulation des cellules cardiaques, ou électroporation membrane cellulaire [3, 4, 5, 6 , 7]. Avec des formes simples cellules, ΔΦ peut être calculé analytiquement. Par exemple, pour une cellule sphérique, ΔΦ est donné par l'équation de Schwan s, ce qui indique que la tension est proportionnelle à l'intensité du champ et de la taille des cellules et suit la fonction cosinus long de la membrane [8, 9]. Pour plus de formes cellulaires complexes, ΔΦ peuvent s'écarter considérablement de la cosinus et doit être déterminée soit numériquement, en utilisant un ordinateur [2, 10, 11], ou expérimentalement, en utilisant un colorant potentiométrique [12, 13, 14, 15].

Un des colorants potentiométrique largement utilisés à cette fin est di-8-ANEPPS (di-8-butyl-amino-naphtyl-éthylène-pyridinium-propyl-sulfonate), un colorant rapide avec excitation et d'émission des spectres dépendant de la tension de membrane, qui permet des observations non invasif des variations de l'ΔΦ sur la membrane cellulaire et de mesurer sa valeur. Dans cette vidéo, nous montrons une approche expérimentale pour la détermination de ΔΦ en utilisant di-8-ANEPPS.

Le colorant a été développé par le professeur Leslie Loew et ses collègues [13, 14] à l'Université du Connecticut et appartient à la classe des colorants à réponse rapide. di-8-ANEPPS est non fluorescent dans l'eau et devient fortement fluorescent lorsque l'intègre dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire. Un changement dans les résultats ΔΦ à un changement de la distribution de charge intramoléculaire et les changements correspondants dans le profil spectral et l'intensité de la fluorescence du colorant. L'intensité de fluorescence des di-8-ANEPPS varie proportionnellement à la variation des ΔΦ, la réponse de la teinture est linéaire pour des tensions allant de -280 mV à 250 mV [4, 16]. Des changements relativement petits de la fluorescence du colorant, coloration de la membrane inégale, et l'internalisation de teinture font di-8-ANEPPS moins approprié pour des mesures absolues de la tension de la membrane, par exemple, sa composante de repos, même si ces efforts ont également été rapportés [17]. Il est, cependant, adapté à la mesure de plus grands changements dans la tension de membrane, tels que l'apparition de la tension de la membrane induite dans les cellules exposées nonexcitable aux champs électriques externes [12, 13], ou de potentiels d'action dans les cellules excitables [4, 5]. Même s'il n'est pas appliqué ici, di-8-ANEPPS permet également la détermination de ΔΦ par des mesures d'excitation de fluorescence ratiométrique [18] ou de l'émission [19], ce qui augmente la sensibilité de la réponse et réduit les effets mentionnés ci-dessus. Comme di-8-ANEPPS taches de la membrane, il peut également être utilisé simplement comme un marqueur de membrane [2].

Un des inconvénients de la teinture, c'est qu'il est enclin à photoblanchiment, de sorte que les expositions prolongées à la lumière forte devrait être évitée. Calibrage de la teinture est réalisée soit avec valinomycine (i) ionophore de potassium et d'un ensemble de différentes concentrations de potassium en milieu externe [2,18], ou (ii) de patch-clamp en mode voltage [17].

Enfin, avec les mesures de ΔΦ sur les cellules sphériques et des cellules de formes plus complexes, la vidéo montre l'influence de la forme de la cellule sur la distribution spatiale de l'amplitude et ΔΦ. Ainsi, pour les cellules sphériques ΔΦ est proche d'un cosinus, en accord avec l'équation de Schwan, tandis que pour des formes plus compliquées de cellules de la distribution spatiale des ΔΦ est plus complexe [20] ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
di-8-ANEPPS	Invitrogen	D-3167	potentiometric fluorescent dye
pluronic	Invitrogen	P3000MP	potassium ionophore
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
SMEM	Sigma-Aldrich	M8167 or M4767	Spinner modification of the Minimum Essential Medium
Ham-F12	Sigma-Aldrich	N4888	culture medium
fetal calf serum	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Lab-Tek II	Nalge Nunc international	155379	chamber
DC voltage supply	Elektro-Automatik
microprocessor-controlled switcher	Custom Made
electrodes	Custom Made		Pt/Ir